危晴，楊國偉，*，王曉杰，胡雪霞，陳亮

（1.北京電子科技職業(yè)學院，北京 100029；2.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029）

鎖陽（Cynomorium songaricum Rupr.）是鎖陽科鎖陽屬的單科單屬單種植物，是一種不含葉綠素的全寄生植物[1]。在中醫(yī)上把植物鎖陽的去花序干燥莖用做傳統(tǒng)的中藥鎖陽，又名“不老藥”、“金不換”和“沙漠人參”等。明代《本草綱目》記述：“鎖陽性溫，補腎，益精血，潤燥養(yǎng)精治痿弱”。近年來研究證明，它還有防癌、抗癌，免疫調(diào)節(jié)，延緩衰老，對防治心血管疾病有明顯的效果[2－3]。熊果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，具有抗癌、肝損傷保護、抗菌消炎和抗病毒等多方面的應用，應用前景廣闊。目前熊果酸的提取方法主要有微波萃取法、熱回流提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法等[4－6]。索氏提取法利用溶劑的回流和虹吸原理，使固體物質(zhì)連續(xù)不斷地被純?nèi)軇┨崛?，縮短了提取時間，萃取效率較高。本實驗以鎖陽為原料，采用索氏提取法提取熊果酸，在單因素實驗的基礎上，利用正交實驗法優(yōu)選出提取熊果酸的最佳工藝條件，為進下一步開發(fā)鎖陽的利用價值提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料、試劑

鎖陽：甘肅省張掖平西湖地區(qū)產(chǎn)；熊果酸標準品：北京恒元啟天化工技術研究院；香草醛、無水乙醇、冰醋酸、高氯酸、活性炭、石油醚（30℃～60℃）等試劑：均為分析純。紗布：科護醫(yī)療器械。

1.1.2 儀器

CARY—50型分光光度計：VARIAN公司；T6新世紀型分光光度計；AR2140型電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；LABOROTA 4000旋轉蒸發(fā)儀：Heidolph公司；SHB—II瞻環(huán)式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。恒溫水浴鍋HH－S：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；粉碎機：瑞安市百信藥機器械廠；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海蘇達實驗儀器有限公司；Dragon－Med移液槍：大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；標準篩：新鄉(xiāng)市三圓堂機械有限公司；索氏提取裝置一套：北京科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備[7]

準確稱取5 g的鎖陽粉末（粉碎機粉碎，過40目篩）用紗布包好，放入索氏提取器中，按照不同的料液比加入體積分數(shù)為75%～95%的乙醇溶液，加熱到提取溫度，回流提取3 h后，過濾，濾渣再用相同的方法提取一次。合并濾液，減壓濃縮，將濃縮液倒入比色管中，用10 mL石油醚浸泡24 h。然后把石油醚揮干，用10 mL無水乙醇溶解，再加入0.5 g活性炭脫色，攪拌過濾，重復操作，直至濾液無色，把濾液轉移至比色管中，并用無水乙醇定容至10 mL，即得樣品溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備[8]

準確稱取105℃干燥至恒重的熊果酸標準品10.20 mg，用無水乙醇溶解后配制成100 mL的溶液，即得濃度為0.102 0 mg/mL的熊果酸對照品溶液，備用。

1.2.3 標準曲線的繪制[8]

用移液槍準確吸取對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于25 mL比色管中，加熱揮去溶劑，再加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸1 mL。在60℃水浴中加熱15 min，取出放在冰水中冷卻，再加入5 mL冰醋酸搖勻，5 min～60 min內(nèi)在548 nm處測定吸光度。以未加對照品的比色液做空白，在波長548 nm處測定吸光度值。

1.2.4 樣品中熊果酸含量的測定

吸取除雜后的樣品溶液0.5 mL，用無水乙醇定容至25 mL，搖勻后吸取1 mL加入比色管，按照標準曲線繪制方法測定吸光度，計算提取液中熊果酸質(zhì)量百分比：

式中：C為熊果酸濃度，（mg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；V為最初定容體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 乙醇濃度對提取率的影響

分別用濃度為75%、80%、85%、90%、95%的乙醇，在料液比1∶20、提取溫度90℃、提取時間3 h，提取2次的條件下進行提取，測定提取液中熊果酸的含量。

1.2.5.2 料液比對提取率的影響

分別按 1 ∶15、1 ∶18、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 的料液比（g/mL），在乙醇濃度為90%、提取溫度為90℃、提取時間3 h、提取次數(shù)為2次的條件下進行提取，測定提取液中熊果酸的含量。

1.2.5.3 提取時間對提取率的影響

在乙醇濃度為90%、提取溫度為90℃、料液比為1 ∶20（g/mL）的條件下，分別用 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，提取2次，測定提取液中熊果酸的含量。

1.2.5.4 溫度對提取率的影響

乙醇濃度為90%、料液比為1∶20（g/mL）、提取次數(shù)為 2 次、每次 3 h 的條件下，于 80、85、90、95、100 ℃提取，測定提取液中熊果酸的含量。

1.2.6 正交試驗

通過單因素試驗對上述不同提取工藝參數(shù)進行了初步的篩選，為了分析參數(shù)影響主次因素，得到最佳提取工藝，進行正交實驗，參照單因素實驗結果，以影響熊果酸提取率的乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間為4個影響因素，在其3個水平L9（34）進行正交試驗，優(yōu)化最佳提取工藝。L9（34）因素水平見表1。

表1L9（34）因素水平表Table 1Factors and levels of L9（34）orthogonal test

2 結果分析

2.1 標準曲線的繪制

以吸光度（A）為縱坐標，對照品溶液濃度（C）為橫坐標作圖，繪制標準曲線。所得標準曲線的回歸方程為y=0.581 x+0.004 4，相關系數(shù)R2=0.999 8。結果表明，熊果酸在0.020 4 mg～0.102 0 mg范圍內(nèi)，熊果酸含量與其吸光度值線性關系良好。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對提取率的影響

乙醇濃度度提取率的影響結果見圖1。

從圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，熊果酸的含量逐漸增加，但是增加幅度比較緩慢。可能是隨著乙醇濃度的增加，熊果酸的溶解度逐漸增大，同時一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強的成分溶出量也增加，這些成分與熊果酸競爭同乙醇－水分子的結合，因此隨著乙醇濃度的增加，熊果酸的提取率雖在逐漸增加，但增幅很小，考慮到成本的問題，一般乙醇的濃度在80%～95%之間較好。

圖1 乙醇濃度對熊果酸提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of UV

2.2.2 料液比對提取率的影響

料液比對提取率的影響結果見圖2。

圖2 料液比對熊果酸提取率的影響Fig.2 Effect of liquid solid ratio on the extraction efficiency of UV

從圖2可以看出，隨著料液比的減小熊果酸的提取率先增加后降低。原因可能是在一定范圍的料液比中，增大溶劑的用量，容易把一些不易溶出的成分提取出來，同時，過小的料液比會造成溶劑和能源的浪費，造成熊果酸提取率的降低，故選取1∶20（g/mL）左右料液比較為合適。

2.2.3 提取時間對提取率的影響

提取時間對提取率的影響結果見圖3。

圖3 提取時間對熊果酸提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of UV

從圖3可以看出，隨著提取時間的不斷延長，提取率基本無變化?？赡苁且驗榛亓鞯臅r間越長，溶劑中熊果酸的濃度和鎖陽粉末細胞中的熊果酸的濃度幾乎相等，達到擴散的動態(tài)平衡，熊果酸的提取率增加速度逐漸變慢，同時從節(jié)約能源的角度考慮，采用提取時間2 h為最佳。

2.2.4 提取溫度對提取率的影響

提取溫度對提取率的影響結果見圖4。

圖4 提取溫度對熊果酸提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of UV

從圖4可以看出，隨著提取溫度的提高，提取率逐漸增加。這是因為溫度升高，分子運動速度加快，增加了溶劑擴散到固體表面以及溶質(zhì)通過擴散離開固體表面的速度，同時也增加了溶劑被固體表面吸附以及熊果酸從固體表面解析的速度，提高了熊果酸在溶劑中的溶解度。但是考慮到儀器和能源的節(jié)約利用，選擇提取溫度為90℃為最佳提取溫度。

2.3 正交試驗結果

從單因素實驗可以看出，提取時間對熊果酸提取率影響不大，因此在正交試驗中固定提取時間為2 h，考慮乙醇濃度、提取溫度、料液比對提取率的影響。

由表2極差分析可知，影響熊果酸得率的主次順序為C＞A＞B，即提取溫度的影響最大，乙醇的濃度次之，料液比影響最小。乙醇索氏提取鎖陽中熊果酸的最佳提取工藝為：A3B1C2D2，即以乙醇濃度為95%，料液比1∶18，提取溫度90℃。按照最佳提取工藝進行提取的熊果酸的提取率為38.21 mg/g。

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗，確定了索氏提取鎖陽中熊果酸的最佳工藝條件為：將5 g鎖陽粉末，在料液比為1∶18，95%乙醇回流提取2 h，提取2次，鎖陽中熊果酸的提取率為38.21 mg/g。在影響鎖陽中熊果酸提取率的四個因素中，提取溫度最大，為最顯著因子，其次為溶劑濃度，提取時間影響最小。

表 正交試驗結果與分析Table 2 Results analysis of orthogonal test

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