張平，張嵐，鮑九枝，李松哲

（1.吉林醫(yī)藥學院軍事體育教學部，吉林吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林吉林 132013）

在正常生理條件下，機體會產生少量的自由基，機體自身的抗氧化系統(tǒng)可以及時清除自由基。運動應激可導致機體自由基產生增加，抗氧化能力降低。運動源性自由基生成的增加是導致疲勞的重要因素之一。為預防和延緩由于自由基代謝引發(fā)的運動性疲勞和氧化損傷，許多學者做了研究，首先，應提高機體本身對自由基的防御能力，通過膳食改變來減少自由基的損害；其次，應重視抗氧化劑的應用，如VE、VC及一些中藥復合物。林蛙油是一種營養(yǎng)保健價值極高的藥食兩用食物具有抗疲勞作用[1－3]，關于林蛙油對運動過程中抗自由基氧化功能的影響研究報道較少。本文通過建立小白鼠運動訓練及一次力竭性游泳的疲勞模型來揭示林蛙油對腓腸肌組織中SOD活性和MDA含量的影響，借助透射電子顯微鏡，從腓腸肌細胞超微結構上來研究林蛙油的抗氧化，保護腓腸肌的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 林蛙油

吉林市市售，－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。按成人日攝入量6 g/60 kg體重的1、5、10倍設計。加水將林蛙油泡發(fā)12 h后，蓋上保鮮膜放入鍋內蒸15 min，冷卻，勻漿，制成所需濃度，冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實驗動物

ICR雄性小鼠，20 g～22 g，65只，由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供，適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗。自由進食和飲水，每日自然光照，室溫22℃～25℃。

1.1.3 主要儀器

TD－5A離心機：湖南凱達湖南凱達科學儀器有限公司；JD－XSC小鼠恒溫游泳池：上海繼德教學實驗器械廠；722分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；JEM－1200EX透射電子顯微鏡：日本；LKB—8800型超薄切片機：瑞典LKB公司；九陽料理機：九陽股份有限公司。

1.1.4 主要試劑

超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測試盒：南京建成生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

將小鼠按體重隨機分為5組，為安靜組、運動組、林蛙油低劑量組、中劑量組和高劑量組。每組13只小鼠，其中安靜組和運動組灌胃蒸餾水，林蛙油各組給予對應的林蛙油勻漿液灌胃，每組灌胃劑量為0.4 mL。每周稱重一次，調節(jié)林蛙油灌胃劑量。

1.2.2 小鼠運動模型的建立

運動組和林蛙油各劑量組進行4周的游泳訓練，水深不低于40 cm，水溫（26±2）℃，每周訓練 6 d，休息1 d，每次灌胃30 min后進行游泳訓練。第一周每天游泳30 min，以后每周運動時間遞增15 min。第4周后最后1 d灌胃30 min后，各組進行無負重力竭性游泳，記錄游泳時間。游泳至力竭判斷標準為：小鼠沉入水中8 s不能自主浮上水面，且放在平面上無法完成翻正反射，記錄小鼠自游泳開始至沉入水中8 s不能浮起時間。

1.2.3 腓腸肌組織超氧化物歧化酶活性（SOD）和丙二醛（MDA）含量測定

于第4周最后1 d，力竭運動后，眼球取血，斷頭處死，取左后肢相同部位腓腸肌組織，4℃預冷，生理鹽水洗凈，于冰水中用電動勻漿機制成100 g/L的勻漿液，3 000 r/min，離心 10 min，取上清液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。超氧化物歧化酶活性（SOD）、丙二醛（MDA）含量測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，測試方法嚴格按照試劑盒內說明書進行。

1.2.4 透射電鏡腓腸肌標本制備

各組隨機取小鼠3只，斷頭處死，取右側腓腸肌，將其切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm組織塊，放在2.5%戊二醛4%多聚甲醛固定液中，1%鋨酸后固定，梯度丙酮脫水，Epon812包埋，超薄切片機LKB—8800切片，透射電子顯微鏡JEM－1200EX進行觀察照相。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數據以±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，各組間差異采用SNK檢驗。

2 結果

2.1 不同劑量林蛙油對游泳訓練小鼠游泳至力竭時間的影響

林蛙油對游泳訓練小鼠游泳至力竭時間的影響，見表1。

表1 林蛙油對游泳訓練小鼠游泳至力竭時間的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of Rana oil on trained mice swimming exhausted time（±s，n=10）

表1 林蛙油對游泳訓練小鼠游泳至力竭時間的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of Rana oil on trained mice swimming exhausted time（±s，n=10）

注：與安靜組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與運動組比較 ，#p＜0.05，##p＜0.01。

組別 力竭時間/min對照組 95.90±8.41運動組 111.00±10.36低劑量組 111.40±7.24中劑量組 286.80±59.01##高劑量組 243.50±48.65##

由表1可知，游泳訓練能顯著延長小鼠力竭性游泳時間。游泳訓練的同時補充林蛙油，可使力竭性游泳時間進一步顯著延長。林蛙油各劑量組小鼠游泳時間中劑量組最高，各劑量組與訓練運動組比較，中、高劑量組有顯著差異（p＜0.01）。

2.2 不同劑量林蛙油對運動訓練小鼠腓腸肌SOD活性和MDA含量的影響

林蛙油對運動訓練小鼠腓腸肌SOD活性和MDA含量的影響見表2。

表2 林蛙油對游泳訓練小鼠腓腸肌SOD活性和MDA含量的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of Rana oil on trained mice gastrocnemius muscle SOD activity and MDA content（±s，n=10）

表2 林蛙油對游泳訓練小鼠腓腸肌SOD活性和MDA含量的影響（±s，n=10）Table 2 Effect of Rana oil on trained mice gastrocnemius muscle SOD activity and MDA content（±s，n=10）

注：與安靜組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與運動組比較，#p＜0.05，##p＜0.01。

組別SOD/（U/mgprot）MDA/（nmol/mgprot）安靜組 21.12±1.98 5.24±0.96運動組 11.99±1.72** 6.96±1.23**低劑量組 13.03±1.62 5.48±0.99##中劑量組 14.56±1.06# 5.19±0.76##高劑量組 14.10±1.31# 4.97±0.19##

表2結果表明，運動組SOD活性顯著降低，與安靜組比較，有顯著差異（p＜0.01）；與林蛙油各劑量組比較，中、高劑量組有顯著差異（p＜0.05）。運動組MDA的含量最高，與安靜組比較，有顯著異（p＜0.01）與林蛙油各劑量組比較，均有顯著異（p＜0.01）。

2.3 林蛙油對游泳訓練小鼠腓腸肌組織超微結構的影響

圖1 對照組腓腸肌×6 000Fig.1 Gastrocnemius of control group×6 000

圖2 對照組腓腸肌×10 kFig.2 Gastrocnemius of control group×10 k

對照組腓腸肌細胞核仁明顯，核膜清晰，核內常染色質多，胞質內肌原纖維排列緊密，明、暗帶肌節(jié)結構清晰，可見少量線粒體位于肌原纖維之間和較多糖原顆粒（見圖1、圖2）。運動組腓腸肌細胞核內異染色質增多，核基質略致密，肌原纖維上肌節(jié)結構可辨，但呈致密狀，線粒體嵴斷裂，呈空化狀（見圖3、圖4）。林蛙油運動組腓腸肌細胞核內異染色質略增多，肌原纖維上肌節(jié)結構清晰，其間可見少量線粒體位和較多糖原顆粒，但略呈致密狀，個別線粒體致密、局部空化。（見圖 5、圖 6）。

圖3 運動組腓腸肌×7 500Fig.3 Gastrocnemius of trained group×7 500

圖4 運動組腓腸肌×12 kFig.4 Gastrocnemius of trained group×12 k

圖5 林蛙油運動組腓腸肌×7 500Fig.5 Gastrocnemius of Rana oil trained group×7 500

圖6 林蛙油運動組腓腸肌×10 kFig.6 Gastrocnemius of Rana oil trained group×10 k

3 討論

急性運動和力竭運動都可以導致內源性氧自由基生成增多，自由基在肌肉運動性損傷和運動性疲勞中起著重要的作用[4]，由于肌肉是運動的最直接部位，其能量消耗劇烈，局部耗氧增多，因而在運動中及運動后肌肉中自由基迅速增多，同時消耗大量抗氧化酶。研究表明：肌肉是機體抗氧化酶活力最低的組織之一，但其在運動中血流量能增加幾十倍，氧耗的急劇增加造成了氧自由基的大量生成。這些驟然增多的自由基與生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應而引起膜結構的改變，嚴重時即有肌細胞腫脹、壞死等改變。SOD作為體內的抗氧化酶，可反映清除自由基的能力。MDA作為脂質過氧化反應產物，其含量能間接反映機體內自由基的產生情況和機體組織細胞的脂質過氧化程度。本實驗中，運動組小鼠腓腸肌SOD活性降低，MDA含量增加，提示在長時間劇烈運動導致小鼠腓腸肌中自由基大量生成，脂質過氧化反映增加，這與文獻報導基本相一致[5-6]。林蛙油組小鼠運動后腓腸肌SOD活性高于運動組，MDA含量低于運動組。表明補充林蛙油可降低脂質過氧化反應，提高機體的抗氧化能力，減輕運動引起的腓腸肌細胞的損傷。

許多學者研究發(fā)現(xiàn)，經過急性力竭或劇烈運動后，電鏡結果表明，骨骼肌組織形態(tài)結構的變化表現(xiàn)為，肌節(jié)排列不整，線粒體出現(xiàn)髓樣化、嵴斷裂、缺失，部分線粒體可見明顯水腫現(xiàn)象等[7-8]。本研究結果表明，小鼠力竭運動后，也有相似的結構變化，補充林蛙油可使腓腸肌細胞損傷減輕。這可能是林蛙油能提高腓腸肌細胞SOD活性和降低MDA含量，有利于自由基的清除。表明林蛙油具有保護腓腸肌細胞正常結構，增強機體防御體系的功能，進而防止運動性損傷及提高運動能力，也為林蛙油的深度開發(fā)提供理論和實驗依據。

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