李利華

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000）

芹菜（Apium graveolensL.），英文名 celery，芹屬傘形花科一、二年生草本植物，是我們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｊ秤玫囊环N蔬菜。古代本草記載其具有“補(bǔ)血、祛風(fēng)、健脾利濕”的作用和一定的藥用保健功能，因而人們稱之為“廚房里的藥物”[1]。芹菜含有豐富的黃酮類物質(zhì)，如芹菜素、芹菜苷、水蓼素、7-甲基水蓼素等[2]。研究表明黃酮具有多種生物活性[3-5]，主要表現(xiàn)為具有降低血管脆性及異常的通透性、降血脂、降血壓、抑制血小板聚集及血栓形成、抗氧化、抗菌、抗病毒等，而這些生理活性多與其抗氧化作用有關(guān)。目前對(duì)芹菜黃酮的研究已取得一定的進(jìn)展[6-8]，發(fā)現(xiàn)不同品種的芹菜黃酮含量差異很大，但對(duì)整株芹菜不同部位黃酮的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以漢中當(dāng)?shù)厍鄄藶檠芯繉?duì)象，采用Al（NO3）3絡(luò)合分光光度法對(duì)其根、莖、葉中總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，并以VC（抗壞血酸）為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)4種不同的抗氧化體系比較評(píng)價(jià)各部位黃酮提取物的抗氧化性能，旨在為芹菜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮整株芹菜：購(gòu)于漢中蔬菜市場(chǎng)，將芹菜用蒸餾水洗凈后將根、莖、葉分開(kāi)，置于40℃烘箱干燥至恒質(zhì)量，粉碎后過(guò)40目篩備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；無(wú)水乙醇、硝酸鈉、硝酸鋁、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、抗壞血酸、鄰苯三酚、三羥基氨甲烷、鐵氰化鉀、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

GB-204電子天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；TDL-5臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 不同部位提取物的制備

分別精密稱取芹菜根、莖、葉干粉樣品5.0 g，置于3個(gè)250 mL圓底燒瓶中，用石油醚脫脂、脫色后，在各樣品中加入70%的乙醇100 mL，75℃下回流浸提2 h，過(guò)濾，濾渣再浸提一次，合并濾液，減壓濃縮并定容至25 mL容量瓶中，搖勻備用。

1.2.2 總黃酮含量的測(cè)定

采用Al（NO3）3絡(luò)合比色法[9]。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0 、8.0、10.0 mL 于 7個(gè)25 mL容量瓶中，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.75 mL，搖勻，放置5 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.75mL，搖勻，放置5 min，再加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用70%乙醇稀釋至刻度，放置15 min，在510 nm處測(cè)吸光度，以試液空白為參比，平行測(cè)定3次。以蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：A=8.451 3C+0.003 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4。

樣品的測(cè)定：精密移取待測(cè)樣液5.0 mL于25 mL容量瓶中，按上述方法測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量：

總黃酮含量（mg/g）=（C×25×n）/m

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得樣品濃度值，（mg/mL）；n為提取液稀釋倍數(shù)；m為樣品稱樣量，g。

1.2.3 抗氧化性研究

1.2.3.1 對(duì)羥自由基（·OH）清除作用的測(cè)定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[10]。向反應(yīng)管中依次加入5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL，PBS緩沖液（pH7.4）3.8 mL和不同濃度樣液1.0 mL，充分混勻，加5 mmol/L硫酸亞鐵1.5 mL，混勻，加0.1%的過(guò)氧化氫1.0 mL，加水稀釋至10 mL，37℃保持30 min，536 nm下測(cè)定其吸光度，記作A樣；同上操作，不加雙氧水作為未損傷管，測(cè)吸光值記為A未損；不加樣品液作為損傷管，測(cè)吸光度為A損；配置同濃度的VC試劑做陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品平行3次，取平均值。按下式計(jì)算對(duì)·OH清除率：

·OH清除率/%=（A樣品-A損傷）/（A未損-A損傷）×100

1.2.3.2 對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除作用的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[11]。向反應(yīng)管中依次加入0.05 mol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液6.0 mL和不同濃度樣液1.0 mL（空白管以1.0 mL蒸餾水代替），充分混勻后于25℃水浴恒溫25 min，加入8 mmol/L的鄰苯三酚溶液1.0 mL，迅速混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)4 min后加入濃HCl兩滴溶液終止反應(yīng)，于325 nm下測(cè)定吸光度；每個(gè)樣品平行3次，取平均值。按下式計(jì)算對(duì)O2-·清除率：

O2-·清除率/%=（A空白-A樣品）/A空白× 100

1.2.3.3 對(duì)亞硝酸鹽（NO2-）清除作用的測(cè)定

采用鹽酸萘乙二胺法[12]。向反應(yīng)管中依次加入5 μg/mL的亞硝酸鈉3.0 mL，pH3.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液5.0 mL和不同濃度樣液2.0 mL，混勻，于37℃保溫15 min，取出后立即加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸 2 mL，搖勻，靜置 3 min～5 min，加入 0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL，加水至刻度混勻，靜置15 min，在538 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。分別以相應(yīng)濃度樣液做空白試驗(yàn)。每個(gè)樣品平行3次，取平均值。按下式計(jì)算清除率：

清除率/%=（A空白-A樣品）/A空白×100

1.2.3.4 還原能力的測(cè)定

采用普魯士藍(lán)法[13]。向反應(yīng)管中依次加入0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH6.6）2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL和不同濃度樣液1.0 mL，混勻后于50℃保溫20 min，快速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸之后混勻，于5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上層液體2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻，在700 nm下測(cè)定吸光度，吸光度越大，還原力越強(qiáng)。以同濃度樣品溶液代替樣品做空白試驗(yàn)，每個(gè)樣品平行3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

按照1.2.2黃酮含量的測(cè)定方法，測(cè)得芹菜根、莖、葉中總黃酮含量結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 芹菜根、莖、葉的總黃酮含量Table1 Contents of total flavonoids in roots，stems and leaves from celery

由表1可看出，芹菜各部位總黃酮含量差異較大，葉中總黃酮含量最高，莖次之，根最低；葉中總黃酮含量分別是莖和根的3.76倍和5.41倍。

2.2 抗氧化活性研究結(jié)果

2.2.1 對(duì)羥自由基（·OH）清除作用

·OH被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的活性氧自由基，可直接損傷各種生物膜，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，輻射損傷等物理理化因子都會(huì)促進(jìn)其形成。芹菜根、莖、葉提取物對(duì)·OH的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 芹菜根、莖、葉提取物對(duì)·OH的清除作用Fig.1 Scavenging effect of roots，stems and leaves extracts from celery on·OH free radicals

由圖1可看出，芹菜根、莖、葉提取物對(duì)FeSO4－H2O2體系產(chǎn)生的·OH具有明顯的清除作用，且清除率與提取物濃度呈良好的量效關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)各提取物對(duì)·OH清除作用強(qiáng)弱順序?yàn)椋喝~＞莖＞根；對(duì)比VC可見(jiàn)，同等條件下芹菜根、莖、葉提取物對(duì)·OH的清除能力均強(qiáng)于VC，說(shuō)明芹菜提取物所含黃酮類物質(zhì)是一類良好的·OH清除劑。

2.2.2 對(duì)超氧陰離子自由基（O2－·）清除作用

O2－·是活性氧的一種，是機(jī)體內(nèi)壽命最長(zhǎng)的自由基，通常作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強(qiáng)的自由基。芹菜根、莖、葉提取物對(duì)O2－·的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 芹菜根、莖、葉提取物對(duì)O2-·的清除作用Fig.2 Scavenging effect of roots，stems and leaves extracts from celery on O2-·free radicals

由圖2可看出，芹菜根、莖、葉黃酮類物質(zhì)對(duì)O2－·都具有較強(qiáng)的清除作用，且隨著提取物濃度的增加，清除率明顯上升，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各提取物對(duì)O2－·的最大清除率分別為：葉93.12%，莖63.98%，根46.86%，對(duì) O2－·的清除作用強(qiáng)弱順序：葉＞莖＞根；比較VC，同等條件下葉提取物對(duì)O2－·的清除能力與VC相當(dāng)，根和莖提取物對(duì)O2－·的清除能力均低于VC。

2.2.3 對(duì)亞硝酸鹽（NO2－）的清除作用

NO2－是一類強(qiáng)的致癌物質(zhì)，在體內(nèi)能合成亞硝胺，引起人和動(dòng)物肝臟等多種器官的惡性腫瘤。芹菜根、莖、葉提取物對(duì)NO2－的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 芹菜根、莖、葉提取物對(duì)NO2-的清除作用Fig.3 Scavenging effect of roots，stems and leaves extracts from celery on NO2-radicals

由圖3可看出，芹菜根、莖、葉提取物對(duì)NO2均有較好的清除作用，且清除率隨濃度的增加而增大，對(duì)NO2－的清除作用強(qiáng)弱順序：莖＞葉＞根；與VC相比可看出，莖提取物對(duì)NO2－的清除作用明顯強(qiáng)于VC，最大清除率是VC的1.24倍，這可能是莖提取物中清除NO2－的物質(zhì)活性較高或含量高，而根和葉對(duì)NO2－的清除作用不及VC。

2.2.4 還原能力測(cè)定結(jié)果

抗氧化劑的抗氧化能力與其還原力有關(guān)，還原力越大，抗氧化能力越強(qiáng)。芹菜根、莖、葉提取物的還原能力結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 芹菜根、莖、葉提取物的總還原力Fig.4 Reducing power of roots，stems and leaves extracts from celery

由圖4可看出，隨著濃度的增加，各提取物吸光度均明顯上升，表明還原能力逐漸增強(qiáng)；還原能力強(qiáng)弱順序：葉＞莖＞根；對(duì)比VC，葉提取物還原能力最為顯著，高于同濃度的VC試劑，莖提取物還原能力高于根提取物，但兩者的還原能力均低于同濃度的VC試劑。

3 結(jié)論

芹菜富含黃酮類化合物，本研究測(cè)定結(jié)果顯示芹菜不同部位總黃酮含量差異較大，含量高低順序?yàn)椋喝~＞莖＞根，葉中總黃酮含量最高（40.71 mg/g），其含量分別是莖、根的3.76倍和5.41倍，此結(jié)果與董鈺明[14]等的研究結(jié)果基本一致，但含量略有差異，這可能與芹菜的不同品種、地域及生長(zhǎng)期有關(guān)。在不同的抗氧化體系中，芹菜根、莖、葉黃酮提取物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。各提取物抗氧化活性存在一定的差異，羥自由基（·OH）清除、超氧陰離子自由基（O2－·）清除和還原能力結(jié)果顯示，葉提取物具有較好的抗氧化活性，抗氧化活性依次為：葉＞莖＞根；亞硝酸鹽（NO2）清除結(jié)果顯示，莖提取物對(duì)NO2的清除作用明顯強(qiáng)于葉和根，清除作用依次為：莖＞葉＞根；同一提取物在不同的抗氧化體系中，抗氧化活性也不相同，如葉對(duì)·OH的最大清除率為82.05%，對(duì)O2－·的最大清除率為93.12%，對(duì)NO2－的最大清除率為66.93%，這可能與黃酮類化合物的純度及所含抗氧化成分的種類、結(jié)構(gòu)有關(guān)[15]。如果將其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，從中篩選出具有抗氧化活性的單體化合物，將具有更廣闊的研究?jī)r(jià)值與開(kāi)發(fā)前景。

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