梅芳，陳文學(xué)，胡月英

（1.光明乳業(yè)股份有限公司，上海 200436；2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?570228；3.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南?？?570228）

菠蘿牛奶多肽飲料的研制

梅芳1，陳文學(xué)2，胡月英3

（1.光明乳業(yè)股份有限公司，上海 200436；2.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?570228；3.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南?？?570228）

摘 要：利用菠蘿自身的蛋白酶水解脫脂乳粉中的蛋白質(zhì)，研究菠蘿牛奶比例、溫度、pH、時(shí)間等水解因素以及多肽飲料配方工藝。通過(guò)水解條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最佳水解條件為菠蘿與牛奶的比例為30%，水解溫度為55℃，水解pH為6，水解時(shí)間為4 h。通過(guò)響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到菠蘿牛奶多肽飲料的最佳配方為水解液、β-環(huán)糊精、蔗糖、檸檬酸添加量分別為：30%、1.4%、10.5%、0.225%。

關(guān)鍵詞：菠蘿；脫脂乳粉；水解蛋白質(zhì)；多肽飲料

菠蘿是一種味道可口的水果，菠蘿中富含維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽及各種有機(jī)酸，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富[1]。菠蘿汁酸甜適中、芳香可口，并含有一種特殊的天然消化成分鳳梨酵素，能分解蛋白質(zhì)，幫助消化，促進(jìn)食欲，對(duì)飲食保健最為有用[2]。1891年，Marcno[3]發(fā)現(xiàn)菠蘿汁中含有蛋白水解酶。菠蘿蛋白酶在醫(yī)藥、食品、化妝品等方面有廣泛的應(yīng)用，特別是在水解蛋白制備營(yíng)養(yǎng)口服液上有著良好的應(yīng)用前景[4]。

牛乳不但含有豐富全面的營(yíng)養(yǎng)成分，而且還是生物活性肽的重要來(lái)源，這些活性肽對(duì)于人體健康十分有益[5]。研究表明，牛乳蛋白水解蛋白肽具有調(diào)節(jié)免疫、降血壓、降低膽固醇、延緩衰老、促進(jìn)脂肪代謝、抗過(guò)敏和抗凝血等生理功能[6-9]。近來(lái)，已經(jīng)有大量具有重要生物活性的短肽通過(guò)適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆獾玫?。由于這些蛋白資源十分豐富和廉價(jià)，這些生物活性肽不僅價(jià)格低廉、安全性較高、工藝簡(jiǎn)單，而且容易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，所以這類(lèi)研究越來(lái)越受到科學(xué)家們關(guān)注。其中齊海萍[10]等對(duì)菠蘿乳清蛋白多肽飲料進(jìn)行了研究，所得產(chǎn)品口感良好，品質(zhì)穩(wěn)定。

目前，隨著人們生活水平的不斷提高，人們對(duì)飲食營(yíng)養(yǎng)的要求越來(lái)越高，同時(shí)也刺激了保健食品市場(chǎng)。本試驗(yàn)以脫脂乳粉為原料，通過(guò)菠蘿蛋白酶進(jìn)行水解，研究了乳源活性肽的最佳酶解工藝以及多肽飲料的調(diào)配，為實(shí)際生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

菠蘿、白砂糖、檸檬酸均為食用級(jí)；脫脂奶粉：Fonterra Brands（China）Limited；β-環(huán)糊精：上海熔巖精細(xì)化工有限公司；谷胱甘肽：生工生物（上海）有限公司；三氯乙酸（TCA）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；雙縮脲試劑[11]。

722可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；DENWER型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PL3002-N型電子精密天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JLL30-A型榨汁機(jī)；TG16-WS高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀表有限公司；恒溫水浴鍋：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菠蘿牛奶多肽飲料制作工藝流程：

菠蘿預(yù)處理：挑選八九成熟，外表呈黃色，氣味濃香的菠蘿為原料，洗凈，去皮，切塊，榨汁粗濾，再用離心機(jī)離心分離（4 000 r/min，15 min），取上清液備用。

沖調(diào)：將脫脂乳粉與水按1∶5的比例混合并攪拌至完全溶解。

混合：將沖調(diào)完成的脫脂乳粉與菠蘿汁按照一定比例混合。

調(diào)配：用不同比例調(diào)配得到的多肽飲料，通過(guò)添加白砂糖、檸檬酸、β-環(huán)糊精以感官評(píng)定為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳調(diào)配比例。

1.2.2 多肽濃度的測(cè)定方法

三氯乙酸法，取2.5mL的水解液，加入2.5mL10%的TCA溶液，混合均勻，靜置10 min，在4 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，并用5%的TCA溶液定容，搖勻。然后取6.0 mL上述溶液，加入雙縮脲試劑4.0 mL（樣液∶雙縮脲試劑=3∶2，體積比），混合均勻，靜置10 min，于2 000 r/min離心10 min后于540 nm下測(cè)定OD值。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得水解液中的多肽濃度 C（mg/mL）[12]。

1.2.3 菠蘿汁牛奶多肽飲料水解條件的設(shè)計(jì)

水解液中多肽的濃度會(huì)受到不同的菠蘿汁含量、水解溫度、水解pH、水解時(shí)間等因素的影響，在菠蘿蛋白酶的理論最適條件下，先進(jìn)行單因素水解試驗(yàn)確定響應(yīng)面的試驗(yàn)水平，然后進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳水解條件。以水解液中多肽濃度為指標(biāo)。

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)方案

以水解液中多肽濃度為指標(biāo)，研究水解pH、水解溫度、菠蘿汁含量、水解時(shí)間4個(gè)因素的影響規(guī)律。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定因素水平，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取水解pH、水解溫度、菠蘿汁牛奶的配比、水解時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Levels and factors of experiment

添加白砂糖、檸檬酸、β-環(huán)糊精，將水解液進(jìn)一步調(diào)配，使之符合色、香、味等感官品質(zhì)。通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其因素水平編碼表如表2所示。

表2 飲料調(diào)配試驗(yàn)水平編碼表Table 2 Levels and factors of experiment

1.2.5 感官評(píng)定方法

感官評(píng)定由10位實(shí)驗(yàn)室成員組成，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)審，從香氣、色澤、滋味等方面進(jìn)行評(píng)定以及打分，感官評(píng)定如表3。

表3 菠蘿牛奶多肽飲料感官評(píng)定指標(biāo)Table 3 Sensory evaluation norm of pineapple-milk polypeptide beverage

2 結(jié)果與分析

2.1 水解條件的確定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取10個(gè)50 mL的容量瓶，用5%的TCA溶液依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 和 1.8 mg/mL的谷胱甘肽三肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別取6.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入4.0 mL雙縮脲試劑，混合均勻，靜置10 min，于2 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值。以谷胱甘肽的濃度為橫坐標(biāo)X（mg/mL），OD值為縱坐標(biāo)Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到回歸方程y=0.085x-0.001 8，R2=0.997 7。

圖1 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Glutathione

2.1.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 菠蘿與牛奶的不同配比對(duì)水解液中多肽濃度的影響

FinishingBrands涂裝集團(tuán)是世界上最大的涂裝設(shè)備及系統(tǒng)供應(yīng)商，是諸多涂裝技術(shù)的發(fā)明者和行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者。博蘭智涂裝設(shè)備（上海）有限公司是FinishingBrands涂裝集團(tuán)在中國(guó)的全資子公司，從2005年進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)以來(lái)，致力于推廣“高效、節(jié)能、環(huán)?！钡男峦垦b技術(shù)，為國(guó)內(nèi)各行各業(yè)的用戶(hù)提供產(chǎn)品銷(xiāo)售和服務(wù)支持。

在pH=6，溫度為55℃，菠蘿汁含量不同的條件下恒溫水解4 h，測(cè)得其水解液中的多肽濃度如圖2所示。

圖2 水解時(shí)不同菠蘿與牛奶的配比對(duì)生成多肽含量的影響Fig.2 The influence of pineapple-to-milk ratio on the concentration of peptide

結(jié)果顯示，在菠蘿汁含量為20%時(shí)，多肽濃度達(dá)到最大值，當(dāng)菠蘿汁濃度大于20%時(shí)，隨著菠蘿汁濃度的提高，多肽的濃度反而下降。

2.1.2.2 不同溫度對(duì)水解液中多肽濃度的影響

在pH=6，菠蘿汁含量為30%，不同溫度條件下恒溫水解4 h，測(cè)得其水解液中的多肽濃度如圖3。

圖3 不同水解溫度對(duì)生成多肽含量的影響Fig.3 The influence of temperature on the concentration of peptide

從圖3可以看出，隨著溫度的升高，多肽濃度也逐漸增大，達(dá)到60℃時(shí)多肽濃度達(dá)到最大，當(dāng)溫度再升高時(shí)，多肽濃度開(kāi)始下降，可能是高溫破壞了酶的結(jié)構(gòu)，影響了酶的活性。

2.1.2.3 不同水解時(shí)間對(duì)水解液中多肽濃度的影響

在pH=6，溫度為55℃，菠蘿汁含量為30%的條件下恒溫水解不同的時(shí)間，測(cè)得其水解液中的多肽濃度如圖4。

圖4 不同水解時(shí)間對(duì)生成多肽含量的影響Fig.4 The influence of time on the concentration of peptide

從圖4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽濃度逐漸增加，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于4 h后，反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽的濃度減小。

2.1.2.4 pH條件對(duì)水解液中多肽濃度的影響

在55℃，菠蘿汁含量為30%，不同pH條件下恒溫水解3 h，測(cè)得水解液中的多肽濃度如圖5所示。

圖5 不同水解pH對(duì)水解液中多肽濃度的影響Fig.5 The influence of pH on the concentration of peptide

從圖5可以看出，隨著pH的增大，多肽濃度先逐漸增加，當(dāng)pH為7時(shí)到達(dá)最高，當(dāng)再增大pH，多肽濃度開(kāi)始逐漸降低。

2.1.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

按表1因素與水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

采用SAS對(duì)水解生成多肽的含量進(jìn)行回歸分析得到以下回歸方程，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表5。

回歸方程如下：

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Response surface central composite design layout and experimental results

對(duì)菠蘿水解牛奶生成多肽的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)各因子的偏回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 水解響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Analysis of variance for each term in the fitted regression model

續(xù)表5 水解響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Continue table 5 Analysis of variance for each term in the fitted regression model

表5表明：F1值為3.87，P<0.05，失擬不顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況的擬和的較好。該模型顯著一次項(xiàng)中X1、X2的偏回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明菠蘿牛奶的配比、水解溫度對(duì)水解生成的多肽含量效果有極顯著影響；二次項(xiàng)X2X2、X3X3的偏回歸系顯著，二次項(xiàng)中X4X4的偏回歸系數(shù)達(dá)極顯著水平，其他各項(xiàng)的偏回歸系數(shù)均未達(dá)到顯著水平。

以水解液中的多肽濃度為準(zhǔn)，將其回歸方程用SAS語(yǔ)言進(jìn)行分析，得到最佳方案為：水解pH為6，水解溫度為55℃，水解時(shí)間為4 h，菠蘿汁含量為30%。對(duì)最佳方案進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得水解液中多肽濃度為1.53 mg/mL與理論值的1.52 mg/mL相差不大，所以可認(rèn)為其為最佳方案。

2.2 復(fù)合飲料的最佳配方

飲料的調(diào)配以多肽濃度為依據(jù)，尋找色香味俱佳的最佳配比。其中因素X1（果汁配比/%）的3個(gè)水平因子為6、10.5、 15；因素X2（白砂糖含量/%）的3個(gè)水平因子為1、1.4、1. 8；因素X3（酸含量/%）的3個(gè)水平因子為0.15、0.225、0. 30；因素X4（環(huán)糊精含量/%）的3個(gè)水平因子為 20、30、40。

表6 菠蘿牛奶多肽飲料配料響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Response surface central composite design layout and experimental results for pineapple-to-milk peptide

采用SAS對(duì)感官評(píng)分結(jié)果進(jìn)行回歸分析得到以下回歸方程，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表7。回歸方程如下：

對(duì)菠蘿水解牛奶生成多肽的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，如表7所示，并對(duì)各因子的偏回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明：F1 值為 0.6294，P＞0.05，失擬不顯著，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況的擬和的較好。該模型顯著一次項(xiàng)中X1的偏回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明菠蘿牛奶的配料比對(duì)多肽含量效果有極顯著影響；二次項(xiàng)X2X2的偏回歸系顯著，其他各項(xiàng)的偏回歸系數(shù)均未達(dá)到顯著水平。

表7 菠蘿牛奶多肽飲料響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 7 Analysis of variance for each term in the fitted regression model for pineapple-to-milk peptide

以菠蘿牛奶多肽飲料的多肽濃度為準(zhǔn)，將其回歸方程用SAS語(yǔ)言進(jìn)行分析，得到最佳方案為：白砂糖為10.5%，β-環(huán)糊精為1.4%，酸為0.225%，果汁配比為30%。對(duì)最佳方案進(jìn)行驗(yàn)證，感官評(píng)分為79與理論值的79.318相差不大，所以可認(rèn)為其為最佳方案。

3 結(jié)論

1）菠蘿牛奶多肽飲料的最佳水解條件為：菠蘿汁含量為30%，水解溫度為55℃，水解pH為6，水解時(shí)間為4 h。

2）通過(guò)SAS試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了菠蘿水解牛奶蛋白質(zhì)中的菠蘿牛奶配比、溫度、pH值及時(shí)間4個(gè)主要因素的回歸方程以及菠蘿牛奶多肽飲料中，主要4個(gè)配料因素的回歸方程，此模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)水解的效果。

3）4個(gè)因素對(duì)的風(fēng)味影響大小順序?yàn)椋核庖旱奶砑恿浚睛?環(huán)糊精＞白砂糖＞檸檬酸。白砂糖、奶粉、β-環(huán)糊精、檸檬酸、菠蘿汁最適添加量分別為：10.5%、4.44%、1.4%、0.225%、30%。以此作為配方生產(chǎn)出的飲料色澤明亮，酸甜可口。

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Development of Pineapple-milk Polypeptides Beverage

MEI Fang1，CHEN Wen-xue2，HU Yue-ying3
（1.Bright Dairy&Food Co.Ltd.，Shanghai 200436，China；2.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China；3.College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Abstract：Using the pineapple proteinase in itself hydrolysised the protein of skim milk， the hydrolysis factors including the pineapple milk proportion，the temperature，pH，time and other factors were studied and the prescription was also researched.The optimum condition of enzymatic hydrolysis was determined by response surface test，milk and pineapple 30%，the hydrolysis temperature 55℃，hydrolysis pH 6，and hydrolysis time 4 h.By response surface center combination experimental design the best milk peptide beverage was obtained，such as sugar，hydrolysate，β-CD，citric acid，for respectively 10.5%，30%，1.4%，and 0.225%.

Key words：pineapple；skim milk powder；hydrolyzed protein；peptide drinks

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.016

梅芳（1977—），女（漢），工程師，本科，研究方向：乳及乳制品。

2012-10-07