謝永芳，梁亦龍，王芳霞，熊文娟，徐亞，劉小赟

（重慶郵電大學生物信息學院，重慶 400005）

酶法提取山蒼子精油研究

謝永芳，梁亦龍，王芳霞，熊文娟，徐亞，劉小赟

（重慶郵電大學生物信息學院，重慶 400005）

摘 要：以重組膨脹素和纖維素酶為材料，對山蒼子進行破壁處理后于常壓提取山蒼子精油。檢測山蒼子精油提取得率。結果表明，常規(guī)蒸餾山蒼子，所得精油為4.58，單位為ms/ks；纖維素酶解破壁山蒼子精油，為12.35，纖維素酶加膨脹素酶解破壁山蒼子提取為17.67，膨脹素酶加纖維素酶破壁的山蒼子的精油含量最高，大約比纖維素酶解法高1/3。復合酶法提取山蒼子精油效果最好。

關鍵詞：山蒼子；膨脹素；精油

山蒼子，別名山雞椒（Litsesa cubeba Pers），為樟科木姜子屬植物，是我國的特有香料植物，在中西部資源十分豐富。由于其葉、果實含有大量揮發(fā)性油成分，其主要成分是檸檬醛。具有較強的抗菌作用，可治療流行性感冒、平喘化痰、具有一定的抗過敏、抗血栓、抗心律失常、抗微生物及陰道滴蟲、抗植物害蟲、降解黃曲排毒素等作用。其獨特的香味是合成香料無法比擬的，而且無毒副作用，因此在醫(yī)藥、香料工業(yè)以及化妝品上應用極為廣泛。目前，關于從山蒼子中提取精油的方法研究報道有很多，如蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法等[1-3]，但用酶解法提取精油的研究鮮有報道。該研究以低濃度的NaCl溶液作為鹽析試劑，并協(xié)同生物酶法作用對山蒼子精油的提取工藝進行研究，旨在探索出簡便的提取工藝，為其資源的開發(fā)提供科學的參考。

1 材料與試劑

1.1 材料

山蒼子：采于重慶南山植物園。川棉2802：重慶郵電大學生物信息學院藥用植物重點實驗室保存。

1.2 試劑

巴氏畢赤酵母菌株（P.pastors GSll5）和表達載體pPICZαA均為Invitrogen的產品。質粒pMD18-T、反轉錄試劑盒、限制性內切酶、DNA酶、dNTPs均購自為Takara公司產品。DNA片段回收試劑盒購自百泰克生物工程公司；Trizol、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸等化學試劑均為國產分析純；纖維素酶由鄭州龍和化工有限公司提供。

1.3 培養(yǎng)基

YPAD培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，0.01%腺嘌呤；LB培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 棉花膨脹素（Ghexp）的獲得[4]

2.1.1 引物設計與合成

根據(jù)棉花膨脹素基因序列（NCBI No．AF512542），利用Primer Premier 5.0軟件設計基因特異性引物，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

上游引物：TATTCAACACATCAGCAAGCTT下游引物：ACCCAATGCAGTAAAAGGGCCC

2.1.2 Ghexp克隆

棉種子萌發(fā)至2 cm～3 cm，提取總RNA。以總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈。具體反應體系和反應條件參照TaKaRa公司的RNA PCR試劑盒的使用說明[5]。以cDNA單鏈為模板，反應條件：95℃，5 min，1 次循環(huán)；（92 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min）30 次循環(huán)，最后72℃延伸10 min。經(jīng)質量濃度1%瓊脂糖電泳后，回收目的片段并連接pMD18-T載體，轉化E.coli DH5α，提取質粒，限制性內切酶酶切鑒定正確后送交上海生物工程技術服務有限公司測序。

2.1.3 Ghexp的表達及酶活性檢測

不含信號肽編碼序列的Ghexp基因經(jīng)雙酶切后與采用同樣酶切的表達載體pPICZαA連接，轉化E.coli DH5α，提取質粒，經(jīng)線性化后，根據(jù)畢赤酵母表達說明轉化GS115菌株[6]。提取轉化子基因組DNA進行PCR檢測。用SDS-PAGE分析重組畢赤酵母培養(yǎng)液。利用膨脹素破壞濾紙結晶結構，使濾紙屑脫落的能力測定其活性。按照文獻[7]的方法測定混合液的濾紙酶活性。

2.2 膨脹素、纖維素復合酶對山蒼子的破壁處理

先稱取100 g山蒼子果實，加入500 mL含表達膨脹素的發(fā)酵液，放入組織勻漿器中勻漿。并移入錐形瓶中，向錐形瓶中2.5 g纖維素酶，6 gNaCl，將錐形瓶于42℃（恒溫搖床中充分振蕩。反應時間為24 h，反應完畢后，取混懸液鏡檢。同時用不加膨脹素，不加纖維素酶的做為對照。

2.3 精油提取

充分攪拌后冷藏靜置（如果表面己有油層，可先取出，即得部分粗精油），利用高速離心機（3 000 r/min以上）分離油水混合液，得到粗精油；將粗精油進行精制（分子蒸餾），得到優(yōu)質精油。常規(guī)蒸餾山蒼子精油粉，記為s 1；纖維素酶解破壁山蒼子精油，記為s 2；纖維素加膨脹素酶解破壁山蒼子提取記為s3。提取出的揮發(fā)油用無水硫酸鈉除去水分，密封置于-20℃冷藏。3次重復。精油提取率（ms/ks）=得油量／稱取量。

3 結果與分析

3.1 Ghexp基因序列克隆

獲得Ghexp基因序列，大小為760 bp的基因序列，驗證序列準確性，經(jīng)比對與No.AF512542的基因99%的同源性。結果見圖1。

3.2 Ghexp的表達

Ghexp基因經(jīng)酶切、連接、轉化后，轉化子經(jīng)雙酶切鑒定。經(jīng)電轉化畢赤酵母，提取轉化重組子DNA進行PCR鑒定，以表達載體陽性對照，篩選陽性重組子。以陽性菌株DNA為模板，分別以合成的特異性引物進行PCR擴增，擴展長度與理論一致，說明Ghexp基因已經(jīng)整合于畢赤酵母GS115的基因組中。Ghexp基因表達基因產物能夠有效提高纖維素酶的濾紙酶活（30.21%）。濾紙崩解實驗表明，經(jīng)Ghexp基因表達的處理后的濾紙比GS115培養(yǎng)物上清液處理后的薄，透光性好，纖維較松軟，邊緣崩解明顯。

圖1 PCR擴增結果Fig.1 Amplification results of PCR

3.3 不同方式處理山蒼子精油得率的比較

通過不同方式處理山蒼子，常規(guī)蒸餾山蒼子，所得精油記為s 1；纖維素酶解破壁山蒼子精油，記為s 2；纖維素酶加膨脹素酶解破壁山蒼子提取記為s3。結果如圖 2 顯示，s1 為 4.58 ms/ks，s2 為 12.35 ms/ks，s3 為17.67 ms/ks。

圖2 不同方式提取精油的比較圖Fig.2 Oil from Litsesa cubeba by several shell-broken power

從圖2結果可見，膨脹素酶加纖維素酶破壁的山蒼子的精油含量最高，大約比纖維素酶解法高1/3。

4 討論

膨脹素（expansin）對細胞壁的松弛作用是在細胞壁中的纖維素微纖絲和基質多糖交叉處，以一種非水解方式作用于微纖絲表面，使多聚體網(wǎng)絡間的非共價鍵（氫鍵）可逆斷裂，從而聚合物可發(fā)生滑動，引起細胞壁的伸展，膨脹素的作用在于打斷纖維素微纖絲與半纖維素之間的氫鍵，但不破壞營養(yǎng)物質。膨脹素與壁水解酶相互配合，能促進細胞壁膨脹，從而達到細胞的破壁但卻不損失營養(yǎng)成分[10-13]。本實驗引入基因工程手段，成功地構建了棉花Ghexp的表達載體，利用棉花膨脹素發(fā)酵液與纖維素酶共同作用能有效提高精油的得率，其精油的提取較機械破壁法、單獨使用纖維素酶更高，大約比纖維素酶解法高1/3，為17.67。用此法可節(jié)約成本，相對經(jīng)濟有效，發(fā)酵液中添加的甲醇，可以通過離心棄去，在大規(guī)模生產中，精油在蒸餾過程中甲醇等有害物質可以被去除干凈，不具危害性。因此，使用基因工程產物膨脹素可成為值得探索的一種提取精油的新方法，本研究表明復合酶法提取精油比單純的纖維素酶法提取、蒸餾法提取要效率高。

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[1]張德權,呂飛杰,臺建祥.超臨界CO2流體技術萃取山蒼子油的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26(2):54-57

[2]周欣,莫彬彬.黔產山蒼子油化學成分的氣相色譜/質譜分析[J].貴州大學學報:自然科學版,2001:18(1):45-47

[3]萬德光,陳幼竹楊葉木姜子果實的揮發(fā)油成分分析[J].天然產物研究與開發(fā),2004,16(2):136-137

[4]Harmer S E,Orford S J,Timmis J N.Characterization of six alphaexpansin genes in Gossypium hirsutum(upland cotton)[J].Mol Genet Genomics,2002,268:1-9

[5]Xie Y F,Wang B C,Li B,et al.Construction of cDNA library of cotton mutant(Xiangmian-18)library during gland forming stage[J].COLLOIDS AND SURFACES B-BIOINTERFACES,2007,60(2):258-263

[6]郭梅,路福平,蒲軍,等.雜色云芝漆酶基因在甲醇畢赤酵母中表達條件研究[J].食品研究與開發(fā),2005,27(4):82-84

[7]黃萍,劉剛,余少文,等.黃瓜膨脹素的重組表達及活性分析[J].生物技術,2006,16(2)23-26

[8]羅曼,蔣立科.安徽黃山山蒼子香精油成分GC-MS分析[J].作物研究,2006(3):256-258

[9]萬德光,陳幼竹.楊葉木姜子果實的揮發(fā)油成分分析[J].天然產物研究與開發(fā),2004,16(2):136-137

[10]李連朝,王學臣,荊家海.大豆幼苗下胚軸擴張蛋白的存在及其特性[J].植物學報,1998,40(7):627-634

[11]McQueen-Mason S J,Danlel M Durachko.Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants[J].Plant Cell,1992,4(11):1425-1433

[12]Hayama H,Shimada T,Haj I T.Molecular cloning of a ripening related expansin cDNA in peach:evidence for no relationship between expansin accumulation and change in fruit firmness during storage[J],Journal of Plant Physiology,2000,157(5):567-573

[13]陳愛國,陳進紅.Expansin的研究進展[J].植物學通報,2003,20(6):752-758

Study on Enzymatic Extraction of Litsea Cubeba Pers Oil

XIE Yong-fang，LIANG Yi-long，WANG Fang-xia，XIONG Wen-juan，XU Ya，LIU Xiao-yun
（College of Bioinformatie，Chongqing University of Post and Telecommunication，Chongqing 400005，China）

Abstract：Based on the heterologous expressed expansin and the cellulase，we study on treating Litsesa cubeba Pers.The broken cell wall can be made by cellulase and expansin.The production oil was elucidated.The result showed that it was higher by using compound enzymes than by conventional distillation and cellulose enzyme to break wall.The essential oil was 4.58 ms/ks by conventional distillation，Cellulose enzyme wall-breaking had 12.35 l oils，it was 17.67 by cellulase and expansin over 1/3 higher than cellulose enzymatic hydrolysis.The best effect is by composite enzyme to get oil.

Key words：Litsesa cubeba pers；expansin；oil

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.016

重慶市科委基金（cstc D2009-17）；重慶市教委基金（KJ130520）

謝永芳（1971—），女（苗），副教授，博士，研究方向：生物工程。

2012-10-09