劉振華，仉烈煒，趙佳麗，張清華，王敏忠

(1 山東大學附屬省立醫(yī)院，濟南250021;2 山東中醫(yī)藥大學)

腦出血具有高致殘率及致死率。研究證實，腦出血后血腫灶周存在炎性反應及炎性因子表達，是神經(jīng)元繼發(fā)性損害及神經(jīng)功能障礙加重的原因之一［1，2］。微創(chuàng)血腫清除術能快速緩解血腫壓迫，減輕各種炎性細胞因子對周圍腦組織的損傷［3］。2010年11月～2011年3月，我們觀察了不同時機微創(chuàng)血腫清除術對大鼠腦出血灶周圍組織IL-6、IL-1β水平的影響，探討其表達變化及對神經(jīng)功能的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量260～320 g(購自山東大學醫(yī)學院實驗動物中心)。大鼠腦立體定向儀(STOELTNGCO.620 WHEATLANE型，美國);微量注射儀(瑞沃德生命科技有限公司);微量注射器10 μL(上海高鴿工貿(mào)有限公司);ISP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及模型制備 將90只大鼠隨機分為三組，分別為模型組、微創(chuàng)組和對照組，每組各30只。參照Rosenberg等［4］報道的方法制備模型組、微創(chuàng)組大鼠腦出血模型。用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg)，將其俯臥位固定在立體定位儀上，沿頭皮正中切一長約10 mm切口，暴露前囟，于前囟前0.2 mm中線旁開3 mm處鉆一直徑0.5 mm的小孔，進針深度為5.5 mm，即尾殼核位置。剪尾取血，8 min內(nèi)用微量進樣器緩慢注入自體未抗凝動脈血50 μL，留針10 min，退針后局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。對照組僅在尾殼核位置注射生理鹽水50 μL，其余過程與其他兩組相同。

1.2.2 造模成功標準 采用Bederson評分標準判斷模型是否成功［5］。0分:無神經(jīng)功能缺損;1分:前肢出現(xiàn)屈曲(即提尾懸空實驗陽性);2分:一側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實驗陽性)，伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為;3分:同2分行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)即提尾懸空實驗陽性(自由活動時向癱瘓側(cè)劃圈)。以評分≥2分者為造模成功。

1.2.3 微創(chuàng)血腫清除術 微創(chuàng)組大鼠腦出血造模成功后4 h，重新麻醉后固定在定位儀上，微量注射器抽取尿激酶 10 μL［6］，沿鉆孔處進針深 6.3 mm，緩慢注入尿激酶，5 min內(nèi)注完，等待約45 min后用1 mL注射器代替微量注射器連接真空管外端，利用負壓輕柔緩慢抽吸，抽吸量為總量的30%～40%，緩慢退針常規(guī)創(chuàng)口消毒后縫合皮膚。

1.2.4 標本采集 各組于 6、12、24、48、72 h 時分別行戊巴比妥(0.1 mL/100 g)腹腔注射，麻醉大鼠后開胸，暴露心臟及主動脈，用鈍頭50 mL注射器針頭從左心室尖插入心室，進入主動脈，用手術剪將右心耳剪開，將37℃0.9%氯化鈉溶液從50 mL注射器緩慢推入體循環(huán)，持續(xù)3～5 min，至右心耳流出的液體基本無色，將灌流液換為4%多聚甲醛磷酸緩沖液，繼續(xù)灌流5 min約250 mL，斷頭取血腫靠近皮層側(cè)的腦組織約2 mm×2 mm×2 mm，留大腦置于4%多聚甲醛后固定24 h以上。取出固定液中腦組織標本，常規(guī)脫水、石蠟包埋，固定腦組織。

1.2.5 腦出血灶周周組織中IL-6、IL-1β 檢測 采用免疫組織化學染色。取尾狀核平面切片，按常規(guī)免疫組化技術(PAP法)分別進行染色。然后在光鏡下觀察炎性細胞浸潤等情況。IL-6、IL-1β免疫組化染色均著色于細胞質(zhì)和細胞膜，免疫組化陽性細胞胞質(zhì)和胞膜可見棕黃色顆粒。在緊貼血腫周圍但不包括血腫區(qū)每張切片隨機取4個不重復高倍視野，計算每個高倍視野下的陽性細胞數(shù)。所有切片均在同一強度下、同一放大倍數(shù)下分析，取每一時間點的高倍視野下陽性細胞數(shù)平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，各組數(shù)據(jù)以表示，組間比較用t檢驗，多組、多時點的比較采用Post-hoc方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

模型組 6、12、24、48、72 h 時 IL-6、IL-1β 陽性表達細胞數(shù)高于對照組及手術組(P均＜0.05);手術組各時點IL-6、IL-1β陽性表達細胞數(shù)少于模型組(P均 ＜0.05);手術組各時點 IL-6、IL-1β 陽性表達細胞數(shù)多于對照組(P均＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點腦出血灶周組織IL-6、IL-1β 的表達(個/HP，)

表1 各組大鼠不同時間點腦出血灶周組織IL-6、IL-1β 的表達(個/HP，)

注:與對照組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，*P ＜0.05

組別 n IL-6陽性細胞數(shù) IL-1β陽性細胞數(shù)模型組306 h 47.83 ±16.74 20.37 ±4.16△12 h 66.29 ±18.13 37.58 ±4.34△24 h 68.26 ±19.22 44.29 ±4.21△48 h 73.82 ±19.22 55.32 ±4.26△72 h 82.31 ±17.42 73.71 ±3.98△微創(chuàng)組 306 h 34.67 ±17.21 13.23 ±3.35*12 h 42.72 ±17.33 26.44 ±3.21*24 h 43.53 ±18.24 34.47 ±3.43*48 h 56.42 ±18.22 43.83 ±3.39*72 h 63.71 ±17.83 58.56 ±3.15*對照組 306 h 21.05 ± 7.62 11.05 ±5.3012 h 27.23 ±11.20 17.32 ±3.2024 h 32.31 ±12.22 21.61 ±4.0848 h 37.52 ±16.24 25.91 ±3.8172 h 42.20 ±11.33 24.35 ±4.28

3 討論

腦出血后，血腫灶周圍腦組織存在炎性反應，并表達多種炎性因子，可導致血腫周圍腦組織神經(jīng)功能缺損，進一步造成血腦屏障破壞。急性期出血灶周圍腦組織表達包括IL-6及IL-1β等多種炎性細胞因子。IL-6是分子量為26 kD的細胞因子，存在于機體多種組織、血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、成纖維細胞及某些腫瘤細胞中，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護及神經(jīng)毒性的雙重作用［7］。正常情況下，IL-6能夠促進神經(jīng)修復，還可以促進神經(jīng)生長及分化，抑制IL-1的合成，對神經(jīng)元有保護作用。腦出血后灶周腦組織受到損傷時，膠質(zhì)細胞可誘導產(chǎn)生IL-6。升高的IL-6可引起一系列神經(jīng)損傷:IL-6刺激B細胞在肝臟合成急性反應蛋白和纖維蛋白原;抑制前列腺素I2的產(chǎn)生，引起血管收縮，加重腦水腫;還可增加細胞間黏附分子的表達，使白細胞與內(nèi)皮細胞黏附性增強，導致微循環(huán)障礙，加重血腦屏障破壞和神經(jīng)功能損害［8］。IL-1β是多形核白細胞的直接和間接趨化因子，可以通過刺激內(nèi)皮細胞表達白細胞黏附分子，使白細胞聚集于缺血腦組織，從而加重腦缺血損傷，是觸發(fā)免疫和炎癥反應的重要介質(zhì)［9］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β作為一種炎癥和免疫源性細胞因子，刺激花生四烯酸的代謝，增加氧自由基的釋放，誘導一氧化氮合酶生成，使一氧化氮合成、釋放增加，產(chǎn)生神經(jīng)毒性;誘導興奮性氨基酸，啟動多種細胞因子級聯(lián)反應;還可刺激內(nèi)皮細胞表達白細胞黏附分子，使白細胞聚集在缺血組織，加重腦組織損傷［10］。

腦出血后血腫穿刺清除術的最佳治療時機尚無定論。從手術角度多考慮為出血后4～8 d，這時血腫大部分液化，有利于清除，也不易引起再出血，但導致腦損傷程度加重，故遠期療效不佳。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后6 h各組大鼠即可見血腫周圍組織中有IL-6、IL-1β陽性的神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞，隨時間推移，表達逐漸增加增強，到72 h達到高峰，說明在腦出血早期即有腦內(nèi)的炎癥因子激活。在各個時間點，模型組與對照組比較，IL-6、IL-1β陽性的細胞數(shù)均增多，提示在腦出血后炎癥反應起了重要作用。而微創(chuàng)組IL-6、IL-1β陽性細胞數(shù)表達雖多于對照組，但低于模型組，說明超早期(出血后6 h內(nèi))及時行血腫清除術，不僅解除血腫壓迫引起的腦損傷，同時減輕了炎性因子繼發(fā)的神經(jīng)功能損害。

綜上所述，腦出血后血腫灶周炎性細胞因子IL-6和IL-1β的表達增高是引起出血后神經(jīng)系統(tǒng)損害的重要因素。超早期(出血后6 h內(nèi))進行血腫穿刺清除術可以及時解除血腫壓迫，能夠降低血腫灶周炎性細胞因子對腦組織的損害，保護血腦屏障，減輕腦水腫，最大限度減輕腦出血后神經(jīng)功能的損傷，從而起到腦保護的作用。

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