牛菲菲，徐 紅，王飛艷

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021)

子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性盆腔惡性腫瘤之一，為歐美國家女性生殖系統(tǒng)癌癥發(fā)病率首位［1］，嚴(yán)重威脅著女性健康。研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生進展的具體機制具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧等條件誘導(dǎo)下，促凋亡線粒體蛋白(BNIP3)可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。BNIP3 在肺癌［2］、胃癌［3］、結(jié)直腸癌［4］、胰腺癌［5］等多種實體腫瘤中均存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，但在子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)研究甚少。2011年10月～2012年11月，我們通過qRT-PCR和免疫組化方法，觀察子宮內(nèi)膜癌組織中BNIP3的表達(dá)情況，探討其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2011年9月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床附屬醫(yī)院手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌癌變內(nèi)膜標(biāo)本52例作為子宮內(nèi)膜癌組，均經(jīng)病理檢查確診為內(nèi)膜樣腺癌。患者年齡38～75歲、平均54歲。按照 FIGO(2000年修訂版)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期21例;病理組織分級:高分化(G1)18例，中分化(G2)24例，低分化(G3)10例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。收集同期子宮內(nèi)膜不典型增生的癌前病變內(nèi)膜組織14例作為不典型增生組，患者年齡38～73歲;選擇因子宮肌瘤等良性病變行子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜組織36例作為對照組，患者年齡38～56歲。各組術(shù)中所得標(biāo)本一分為二，一份立即液氮速凍，置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?另一份用10%甲醛液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚約4 μm，用以行免疫組化。各組標(biāo)本術(shù)前均未經(jīng)放化療及激素治療。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，引物由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成。BNIP3引物:上游 5'-TTCCAGCCTCGGTTTCTATTTA-3'，下游5'-GTTGGTATCTTGTGGTGTCTGC-3'，擴增產(chǎn)物長度137 bp;采用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)做內(nèi)參，GAPDH引物:上游5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3'，下游 5'-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，擴增產(chǎn)物長度137 bp。BNIP3兔抗人多克隆抗體購自北京中山生物有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 BNIP3 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。采用Trizol法提取各組組織中的RNA，進行瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計分析，檢驗RNA的純度及完整度，隨后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書及時將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用以進行實時定量PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括:SYBR GreenⅠ熒光染料9 μL，上下游引物各0.5 μL，模板 cDNA 1 μL，雙蒸水(ddH2O)9 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃ 20 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，延伸時檢測熒光信號，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線的分析，BNIP3的基因擴增產(chǎn)物可見呈現(xiàn)單一的特異性熔解峰，曲線平穩(wěn)光滑，波峰的形狀較為銳利，證明產(chǎn)物為特異性擴增。目的基因的擴增情況以傳統(tǒng)的相對定量法(2－ΔΔCt)進行計算分析。

1.3.2 BNIP3蛋白檢測 采用免疫組化SP法。實驗步驟按照試劑盒的說明進行，以自身陽性片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，且染色強度明顯高于背景的非特異著色為陽性表達(dá)。結(jié)果判定采用Formowitz等［6］綜合計分法，每張切片均于高倍鏡(×400)下選擇10個具有代表性的視野，先按陽性細(xì)胞百分比打分:0分為陽性細(xì)胞百分率≤5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%;再按染色強度打分:0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色強度評分與陽性細(xì)胞百分率評分相加:總和＜2分為陰性，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。(+)、(++)、(+++)均視為陽性。

1.3.3 BNIP3表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系記錄各組患者病理分級、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肌層浸潤等，比較各指標(biāo)與BNIP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料用表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析(方差不齊時采用Games-Howell法)，計數(shù)資料選用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BNIP3 mRNA表達(dá) 子宮內(nèi)膜癌組、不典型增生組、對照組BNIP3 mRNA的相對表達(dá)量分別為1.64 ±0.46、1.99 ±0.59、0.82 ±0.23，不典型增生組高于對照組及子宮內(nèi)膜癌組，子宮內(nèi)膜癌組高于對照組(P均 ＜0.05)。

2.2 BNIP3蛋白表達(dá) BNIP3陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分強染色細(xì)胞的細(xì)胞核中也可見陽性表達(dá)。對照組僅見散在的細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)，且染色較淡;不典型增生組陽性表達(dá)以棕黃或棕褐色顆粒為主;子宮內(nèi)膜癌組雖呈現(xiàn)彌漫性細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)，但以淺黃和棕黃色顆粒為主。不典型增生組BNIP3蛋白陽性率高于子宮內(nèi)膜癌組及對照組，子宮內(nèi)膜癌組高于對照組(P均＜0.01)。見表1。

表1 各組BNIP3蛋白表達(dá)

2.3 BNIP3 mRNA及蛋白的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 BNIP3 mRNA及蛋白在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)水平與病理分級、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肌層浸潤等均無關(guān)(P＞0.05)。見表2。

3 討論

腫瘤的形成往往是因為細(xì)胞增殖、分化的機制出現(xiàn)異常，凋亡通路受阻，從而表現(xiàn)為失控性細(xì)胞永生化。BNIP3具有調(diào)節(jié)細(xì)胞自主凋亡的能力，在多種實體瘤中均發(fā)現(xiàn)存在BNIP3的異常表達(dá)，因此BNIP3成為研究腫瘤發(fā)生機制的新熱點，但關(guān)于其在子宮內(nèi)膜癌及其癌前病變中的研究卻鮮有報道。

BNIP3/NIP3基因是隸屬于BcL-2家族中的BH3-only亞型，是缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1ɑ)的下游靶基因，正常機體內(nèi)，BNIP3僅疏松地結(jié)合于線粒體外膜的胞質(zhì)側(cè)，不能發(fā)揮其促凋亡的功能，當(dāng)體內(nèi)凋亡信號出現(xiàn)時，BNIP3表達(dá)上調(diào)，胞質(zhì)中的BNIP3以同源二聚體的方式與線粒體外膜緊密結(jié)合，靠其N端位于胞質(zhì)側(cè)、羧基C末端位于線粒體膜內(nèi)的途徑誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔開放(MPTP)，線粒體功能受損，導(dǎo)致典型細(xì)胞凋亡壞死現(xiàn)象的發(fā)生［7］。

表2 BNIP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，定位于胞質(zhì)的BNIP3是正常發(fā)揮促凋亡功能的前提和保證［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜BNIP3的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，且BNIP3蛋白在子宮內(nèi)膜癌組(86.5%)、不典型增生組(92.9%)患者中的陽性表達(dá)率高于對照組(8.3%)。通過在胰腺癌［5］等腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)陽性表達(dá)以胞核為主時，即使存在BNIP3的高表達(dá)，也無法發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死的能力，甚至?xí)憩F(xiàn)為凋亡逃避的反結(jié)果。因此，本實驗結(jié)果可初步證實上調(diào)的BNIP3參與了正常內(nèi)膜癌變的發(fā)生進展過程。

本研究采用熒光定量PCR技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平檢測了BNIP3的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組及不典型增生組BNIP3 mRNA的平均表達(dá)量均高于對照組，與免疫組化所得出的蛋白水平變化情況相符。Bruick等［9］認(rèn)為，BNIP3在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)是其蛋白表達(dá)上調(diào)的原因之一，因此BNIP3蛋白水平的上調(diào)與BNIP3 mRNA的上調(diào)相比表現(xiàn)相對滯后。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌中BNIP3 mRNA及蛋白表達(dá)并非呈一種典型的漸進過程，雖然BNIP3在正常內(nèi)膜明顯低表達(dá)，在子宮內(nèi)膜不典型增生組及子宮內(nèi)膜癌組高表達(dá)，但是BNIP3在不典型增生組的表達(dá)卻高于子宮內(nèi)膜癌組，推測可能為BNIP3表達(dá)上調(diào)屬于腫瘤發(fā)生過程中的極早期事件，即癌前病變過程中該因子的上調(diào)現(xiàn)象比較明顯，一旦癌前病變進展為惡性腫瘤，BNIP3的表達(dá)將會因為其自身甲基化或抗凋亡因子表達(dá)增多等抑制因素的存在，使得原本表達(dá)上調(diào)的BNIP3無法繼續(xù)正常發(fā)揮作用，或因被抗凋亡因子大量消耗，呈現(xiàn)出表達(dá)相對下調(diào)現(xiàn)象。但由于本研究中不典型增生內(nèi)膜標(biāo)本例數(shù)較少，故BNIP3表達(dá)上調(diào)在子宮內(nèi)膜惡變過程中是否屬于早期分子信號，能否作為早期診斷的輔助指標(biāo)，對于早期診斷子宮內(nèi)膜癌是否具有重大意義，仍需進一步探究。

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