肖 霞，趙明峰，盧文藝，柴 笑，穆 娟，鄧 琦，李 青，李玉明

(天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192)

鐵是人體必需的微量元素，細(xì)胞內(nèi)生理量的鐵在其DNA合成、電子傳遞、氧氣運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過(guò)程中均發(fā)揮了重要的作用。但細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)載卻能夠引起組織器官和細(xì)胞的損傷。一些血液系統(tǒng)疾病如骨髓異常增生綜合征(MDS)、再生障礙性貧血(AA)、地中海貧血等由于骨髓造血功能異常和紅細(xì)胞無(wú)效生成需要長(zhǎng)期依賴輸血。細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的鐵通過(guò)Haber-Weiss反應(yīng)催化活性氧物質(zhì)(ROS)的生成，改變了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)ROS升高及其所致的抗氧化物質(zhì)的相應(yīng)減少，促進(jìn)脂類、蛋白質(zhì)和DNA的氧化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷。而過(guò)多的鐵沉積在肝、脾、心臟、胰腺等器官上，也造成了相應(yīng)器官的衰竭。鐵過(guò)載的相關(guān)研究顯示，在MDS和地中海貧血患者骨髓細(xì)胞中均能發(fā)現(xiàn)自由鐵，且祛鐵治療可改善這些患者的癥狀［1］。國(guó)外研究證實(shí)地中海貧血患者血中ROS水平明顯高于正常人［2］。因此，我們假設(shè)鐵過(guò)載通過(guò)ROS升高影響了骨髓造血功能。2012年3月～2013年3月，我們通過(guò)體外培養(yǎng)臍帶血的過(guò)程中加入枸櫞酸鐵胺建立體外鐵過(guò)載模型，然后檢測(cè)其對(duì)骨髓造血功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所惠贈(zèng)，新鮮臍帶血來(lái)自本院產(chǎn)科足月健康妊娠產(chǎn)婦分娩后，征得產(chǎn)婦及家屬知情同意后用于科學(xué)研究。

1.2 主要試劑 DMEM 低糖培養(yǎng)基、FBS、0.25%胰酶、鼠尾膠原均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞因子IL-3、IL-6、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)、FLT-3 配基(FLT-3 ligand，F(xiàn)L)購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基及H5100培養(yǎng)基購(gòu)自加拿大Stem cell公司，枸櫞酸鐵銨(FAC)、鈣熒光素乙酰氧基甲酯(calcein-AM)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，AnnexinV-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海美季公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.1.1 臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(UC-MNCs)提取與培養(yǎng) 新鮮臍血標(biāo)本肝素抗凝后，采用羥乙基淀粉沉淀法聯(lián)合Ficoll梯度密度離心法分離UC-MNCs，用完全培養(yǎng)液(含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素和細(xì)胞因子 IL-3、IL-6、SCF、FLT-3濃度均為2 μg/L的 RPMI-1640培養(yǎng)液)重懸細(xì)胞，以1×106/mL的密度接種于12孔板中。

1.3.1.2 UC-MSCs 培養(yǎng) 用含 15%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，按1∶3進(jìn)行傳代。取第3代UC-MSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 分為MNCs-CTL組、MNCs-FAC組、MSCs-CTL組、MSCs-FAC組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 鐵過(guò)載模型的建立 MNCs-CTL組、MSCs-CTL組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中。MNCs-FAC組、MSCs-CTL組向培養(yǎng)液中添加200 μmol/L的FAC，培養(yǎng)24 h后離心換液，于完全培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池(LIP)的相對(duì)水平判斷鐵過(guò)載模型建立是否成功。向MNCs-FAC組和MSCs-FAC組培養(yǎng)液中添加200 μmol/L的FAC培養(yǎng)24 h，細(xì)胞內(nèi)calcein熒光強(qiáng)度分別低于MNCs-CTL組和MSCs-CTL組，說(shuō)明MNCs-FAC組和MSCs-FAC組細(xì)胞內(nèi)LIP水平相對(duì)升高，即細(xì)胞外鐵進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)造成細(xì)胞鐵過(guò)載，成功建立鐵過(guò)載模型。

1.3.4 檢測(cè)方法 觀察鐵過(guò)載的UC-MNCs和UCMSCs細(xì)胞內(nèi)LIP、ROS水平變化;觀察鐵過(guò)載對(duì)UCMNCs和UC-MSCs細(xì)胞的增殖、分化、凋亡的影響。

1.3.4.1 造血細(xì)胞集落計(jì)數(shù) 收集MNCs-CTL組和MNCs-FAC組的UC-MNCs細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。在24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔中甲基纖維素半固體培養(yǎng)基0.5 mL，加入各組 MNCs，1 ×105個(gè)。在 37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～14 d后，在顯微鏡下分別對(duì)紅系祖細(xì)胞集落形成單位(CFU-E)、?！獑魏讼底婕?xì)胞集落形成單位(CFU-GM)、爆式紅系祖細(xì)胞集落形成單位(BFU-E)和混合系祖細(xì)胞集落形成單位(CFU-mix)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4.2 各系造血干祖細(xì)胞計(jì)數(shù) 收集 MNCs-CTL組和 MNCs-FAC組的 UC-MNCs 1×106個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌2次后分別加入10 μL CD33-PE、10 μL GlyA-PE 或 10 μL CD34-PE/CD45-FITC 抗體，陰性對(duì)照管加入10 μL PBS，同型對(duì)照管加入人鼠抗IgG2-PE 10 μL，室溫避光孵育 15 min，再用 PBS 洗滌2次后重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。記錄MNCs-CTL組和MNCs-FAC組造血干細(xì)胞()、髓系造血細(xì)胞()、紅系造血細(xì)胞(GlyA+)比例和計(jì)數(shù)。

1.3.4.3 檢測(cè)鐵過(guò)載對(duì)UC-MSCs增殖功能的影響將MSCs-CTL組和MSCs-FAC組P3代的UCMSCs細(xì)胞分別以4×104/孔的密度接種于12孔板上，在37℃的溫箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合的時(shí)候，用胰酶消化傳代，按以下公式計(jì)算UC-MSCs的倍增時(shí)間:DT=CT×log2/log(X1/X0)，X0是細(xì)胞最初的數(shù)量，X1是細(xì)胞最終的數(shù)量，CT是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.4.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將4組的 UC-MNCs和UC-MSCs的細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。取100 μL細(xì)胞懸液于流式管中，加 5 μL Annexin V-FITC 和 10 μL 碘化丙啶(PI)，以PBS組為陰性對(duì)照，混勻后室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.4.5 ROS 測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［3］將 MNCs-FAC 組的細(xì)胞培養(yǎng)2 d后加入FAC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，加入DCFH-DA，使其終濃度為0.5 μmol/L;將 MSCs-FAC組的細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于6孔板上，加入FAC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L;處理細(xì)胞15 min后，洗滌細(xì)胞3次，每孔加入細(xì)胞裂解液700 μL，37℃搖床裂解細(xì)胞10 min后將混勻的裂解液加入到96孔板中，在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、吸收波長(zhǎng)為530 nm下用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造血細(xì)胞集落計(jì)數(shù) MNCs-FAC組各集落形成單位數(shù)均低于MNCs-CTL組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 MNCs造血干祖細(xì)胞集落形成能力變化

2.2.2 各系造血干祖細(xì)胞計(jì)數(shù) MNCs-FAC組MNCs細(xì)胞數(shù)比MNCs-CTL組明顯減少，MNCs-FAC組比例和細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于MNCs-CTL 組(P 均 ＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 鐵過(guò)載對(duì)UC-MSCs功能的影響 MSCs-FAC組UC-MSCs的群體倍增時(shí)間DT為(24.43±2.72)h，MSCs-CTL 組為(16.03 ± 2.31)h，MSCs-FAC 組DT長(zhǎng)于MSCs-CTL組(P＜0.05)，細(xì)胞增殖能力下降。

表1 不同處理組MNCs 、GlyA+細(xì)胞比例和計(jì)數(shù)的變化(n=3，)

表1 不同處理組MNCs 、GlyA+細(xì)胞比例和計(jì)數(shù)的變化(n=3，)

注:與 MNCs-FAC 組比較，﹡ P ＜0.05

MNCs-CTL 組 10.53 ±1.00 0.61 ±0.06﹡ 0.64 ±0.12﹡ 13.26 ±1.02﹡ 14.04 ±2.32﹡ 24.53 ±1.37﹡ 25.77 ±1.58)﹡MNCs-FAC 組 6.60 ±0.36 0.36 ±0.04 0.24 ±0.03 9.86 ±0.48 6.51 ±0.53 18.25 ±1.21 12.06 ±1.26

2.4 細(xì)胞凋亡的變化 UC-MNCs在200 μmol/L的FAC作用24 h后，MNCs-FAC組凋亡率為(20.903.45)%，MNCs-CTL 組為(9.201.29)%，MNCs-FAC組凋亡率高于MNCs-CTL組(P＜0.05)。P3代的UC-MSCs在200 μmol/L的FAC作用24 h后，MSCs-FAC 組的凋亡率為(12.75 ±0.32%)，MSCs-CTL組為(3.63±0.80%)，MSCs-FAC 組的凋亡率高于 MSCs-CTL組(P ＜0.05)。

2.5 鐵過(guò)載臍帶血細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化 MNCs-FAC組和MSCs-FAC組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，均高于MNCs-CTL組和MSCs-FAC組(P均＜0.05)。見(jiàn)圖2

3 討論

圖2 鐵過(guò)載對(duì)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞ROS水平的影響

一些血液系統(tǒng)疾病如MDS、AA、地中海貧血等需要長(zhǎng)期依賴輸血，導(dǎo)致鐵過(guò)載的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的治療效果和預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)地中海貧血患者骨髓的LIP水平和ROS水平明顯高于正常人，祛鐵處理后，紅系祖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中LIP降低，并且與氧化應(yīng)激(ROS)的減弱相關(guān)［4］。因此，明確鐵過(guò)載對(duì)造血功能的影響及其機(jī)制對(duì)臨床改善這些患者的治療和預(yù)后有重要意義。相關(guān)研究提示鐵過(guò)載可造成造血功能的損傷，其機(jī)制可能是由于ROS的升高，但是尚缺乏直接的證據(jù)證實(shí)，如何對(duì)造血干祖細(xì)胞和造血微環(huán)境產(chǎn)生影響也尚不清楚。

臍帶血富含造血干祖細(xì)胞及MSC。UC-MSC與骨髓來(lái)源的MSC相似，具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等分化潛能，它還可通過(guò)細(xì)胞接觸和分泌細(xì)胞因子支持造血。本研究利用體外培養(yǎng)UCMNCs和UC-MSCs的方法檢測(cè)鐵過(guò)載對(duì)造血細(xì)胞及造血支持細(xì)胞的影響，在200 μmol/L的FAC中，培養(yǎng)UC-MNCs和UC-MSCs，檢測(cè)LIP水平增高，提示外源性的鐵可進(jìn)入細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞鐵過(guò)載。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)FAC促使造血干祖細(xì)胞鐵過(guò)載，MNCs-FAC組的比例和細(xì)胞數(shù)均明顯減低，各系集落形成單位明顯降低，凋亡比例明顯增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，說(shuō)明鐵過(guò)載引起了造血干祖細(xì)胞的損傷，誘導(dǎo)ROS升高，可影響造血干、祖細(xì)胞的數(shù)量、分化及功能，損傷骨髓造血功能。MSCs是造血微環(huán)境的重要組成部分，正常的造血微環(huán)境使得造血細(xì)胞增殖、分化。本研究發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載使MSCs的增殖能力、造血支持能力下降且凋亡率增加。有研究證明，體內(nèi)聚集大量的ROS可誘導(dǎo)MSCs的DNA損傷，降低DNA的合成及增殖能力，影響其分化能力，甚至可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老［5］。鐵過(guò)載可造成造血功能的損傷，使造血能力下降，其機(jī)制可能是影響了造血干祖細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及影響了造血微環(huán)境的增殖、凋亡，使其造血支持能力下降。

有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)LIP誘導(dǎo)ROS生成。鐵的動(dòng)態(tài)平衡在許多氧化應(yīng)激涉及的病理過(guò)程中起了重要的作用［6］。細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)水平的ROS在調(diào)控一些生物學(xué)現(xiàn)象中發(fā)揮著重要的作用，包括一些信號(hào)通路的激活以及這些信號(hào)所涉及的基因的表達(dá)。然而，各種原因所致的ROS生成增多直接或間接的破壞正常細(xì)胞內(nèi)的氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)［7］，從而引起細(xì)胞和組織器官的損傷。造血干細(xì)胞對(duì)非正常的ROS的聚集高度敏感，如果干細(xì)胞中ROS長(zhǎng)期升高可導(dǎo)致DNA的損傷和老化機(jī)制的非正常激活，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的老化和凋亡，從而導(dǎo)致造血干細(xì)胞再生能力的破壞［8］，進(jìn)而影響造血干細(xì)胞的自我更新和定向分化能力。ROS升高通過(guò)多種途徑影響造血干細(xì)胞的數(shù)量與活性、自我更新能力和細(xì)胞周期變化等。參與其中的信號(hào)分子主要有 ATM、FoxO、mTOR和AKT等［8］。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ROS大量聚集對(duì)支持造血的MSCs同樣也具有損傷作用，可影響其增殖、凋亡、分化，近年來(lái)，p38MAPK、AKT、p53、ERK等多種信號(hào)途徑在ROS介導(dǎo)的MSC衰老、凋亡及增殖分化中的作用有相繼報(bào)道［10，11］。

綜上所述，鐵過(guò)載是促使ROS升高的原因，且ROS升高影響造血干祖細(xì)胞增殖、分化和凋亡，對(duì)造血支持細(xì)胞尤其是MSCs的增殖及造血支持作用造成損傷，影響了造血功能。因此，我們的研究結(jié)果旨在為治療鐵過(guò)載患者造血功能低下尋找新的靶點(diǎn)(例如祛鐵治療或抗氧化治療等)提供思路，同時(shí)為深入探討ROS對(duì)造血機(jī)制的影響提供依據(jù)。

［1］Ghoti H，Amer H，Winder A，et al.Oxidative stress in red blood cells，platelets and polymorphonuclear leukocytes from patients with myelodysplastic syndrome［J］.Eur J Haematol，2007，79(6):463-467.

［2］Amer J，Goldfarb A，F(xiàn)ibach E.Flow cytometric measurement of reactive oxygen species production by normal and thalassaemic red blood cells［J］.Eur J Haematol，2003，70(2):84-90.

［3］Wang G，Gong Y，Burczynski FJ，et al.Cell lysis with dimethyl sulphoxide produces stable homogeneous solutions in the dichlorofluorescein oxidative stress assay［J］.Free Radic Res，2008，42(5):435-441.

［4］Prus E，F(xiàn)ibach E.Effect of iron chelators on labile iron and oxidative status of thalassaemic erythroid cells［J］.Acta Haematol，2010，123(1):14-20.

［5］Ko E，Lee KY，Hwang DS.Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells undergo cellular senescence in response to oxidative stress［J］.Stem Cells Dev，2012，21(11):1877-1886.

［6］Bendova P，Mackova E，Haskova P，et al.Comparison of clinically used and experimental iron chelators for protection against oxidative stress-induced cellular injury［J］.Chem Res Toxicol，2010，23(6):1105-1114.

［7］Naka K，Muraguchi T，Hoshii T，et al.Regulation of reactive oxygen species and genomic stability in hematopoietic stem cells［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10(11):1883-1894.

［8］Ghaffari S.Oxidative stress in the regulation of normal and neoplastic hematopoiesis［J］.Antioxidants Redox Signaling，2008，10(11):1923-1940.

［9］Ito K，Hirao A，Arai F，et al.Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells［J］.Nature，2004，431(1011):997-1002.

［10］Mimeault M，Batra SK.Recent insights into the molecular mechanisms involved in aging and the malignant transformation of adult stem/progenitor cells and their therapeutic implications［J］.Ageing Res Rev，2009，8(2):94-112.

［11］盧文藝，趙明峰.氧化應(yīng)激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，34(1):90-94.