師憲平，藍(lán)曉瑩，溫創(chuàng)宇，陳 鑫，劉煥亮

(1廣州醫(yī)學(xué)院免疫研究所，廣州 510182;2中山大學(xué)胃腸病學(xué)研究所;3中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是常見的成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)，治療棘手。傳統(tǒng)化療藥物效果不理想，患者5年生存率較低［1］。雷公藤俗名斷腸草，系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，生長于山地林緣陰濕處，治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡和銀屑病效果顯著。研究顯示，雷公藤除具有抗炎和抗移植排斥反應(yīng)外，還有較強(qiáng)的抗腫瘤作用［2］，可抑制白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］;可使人胃腺癌細(xì)胞株MGC80-3異種移植小鼠的腫瘤體積縮小90%［4］。雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)為雷公藤中提取的一種含有3個(gè)環(huán)氧基的二萜內(nèi)酯活性化合物，有顯著的抗腫瘤、抗炎癥等作用［5］。2011年11月～2012年11月，我們觀察了TPL對DLBCL的抑制作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 彌漫性大B淋巴瘤細(xì)胞株SU-DHL-4購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所;MTS、碘化丙啶(PI)、細(xì)胞凋亡雙染檢測試劑盒、吐溫-20(Tween-20)、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma-Aldrich公司;抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Pro-caspase8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Pro-caspase3)、磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(P-ERK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)為Cell Signaling公司產(chǎn)品;抗二磷酸腺苷核糖多聚酶(PRAP)為BD Biosciences PharMingen公司產(chǎn)品;抗X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)、髓樣細(xì)胞白血病-1(Mcl-1)抗體購自Santa Cruze公司;抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、磷酸化信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(P-STAT5)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT5)抗體購自Upstate Technology公司，辣根過氧化物酶(HRP)-抗鼠/兔Ig抗體為Pierce Biotechnology公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將 SU-DHL-4細(xì)胞置于 RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 TPL干預(yù)及細(xì)胞增殖活性檢測 取生長良好的SU-DHL-4細(xì)胞置于96孔板，15000個(gè)/孔，分別采用 0、0.03125，0.0625、0.125、0.25 及 0.5 μmol/L(μM)的TPL作用72 h。于實(shí)驗(yàn)各孔分別加MTS試劑20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔490 nm波長處的吸光度值(A值)。以TPL濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖活性為縱坐標(biāo)繪制SU-DHL-4細(xì)胞增殖活性抑制率曲線。

1.2.3 TPL干預(yù)及細(xì)胞凋亡率測定 取生長良好的SU-DHL-4細(xì)胞(2×105個(gè)/管)，分別采用 0、0.1、0.2、0.3 μM 的 TPL 處理 36 h。處理后收集細(xì)胞，1 ×binding buffer洗滌，AnnexinV 工作液 100 μL室溫孵育15 min，采用AnnexinV/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)(能區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞)測定細(xì)胞凋亡率。檢測前每管加PI 1 μL上機(jī)。按照Sigma-Aldrich公司提供的試劑說明書操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上右下象限代表晚期凋亡細(xì)胞，右上象限代表早期凋亡細(xì)胞，其總和計(jì)為凋亡細(xì)胞。

1.2.4 TPL干預(yù)及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用 0、0.1、0.2、0.3 μM 的 TPL 處理細(xì)胞36 h，再用0.2 μM 的 TPL 處理12、24、36 h(對照組不予TPL處理)。收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞提取蛋白，用Bio-Rad蛋白濃度試劑盒在酶標(biāo)儀中選750 nm波長定量蛋白濃度;100～130 V恒壓電泳約90 min，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜約90 min，5% 牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃過夜，次日曝光，對定性結(jié)果進(jìn)行分析，在保證蛋白上樣質(zhì)量一致的情況下(管家基因所表達(dá)的GAPDH條帶深淺一致)，觀察各蛋白所對應(yīng)條帶的深淺，采用Western blot法測定細(xì)胞凋亡蛋白及增殖蛋白表達(dá)。凋亡蛋白包括 PARP 、Pro-caspase3、Pro-caspase8、XIAP、Mcl-1，增殖蛋白包括 AKT、ERK、STAT5。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 4.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞抑制率比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活性 TPL達(dá)0.125 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯抑制(P＜0.05)，隨TPL劑量增加，細(xì)胞抑制率明顯增高(圖1)。TPL對細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.131 μM。

圖1 TPL對SU-DHL-4增殖活性的影響

2.2 細(xì)胞凋亡率 與對照組比較，各TPL干預(yù)組早期和晚期凋亡細(xì)胞均明顯增加(圖2)，P＜0.05。

2.3 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 見圖3。PARP呈TPL劑量與時(shí)間依賴性切割，Pro-caspase3、Pro-caspase8呈劑量與時(shí)間依賴性降低，而凋亡抑制蛋白XIAP與Mcl-1表達(dá)隨TPL濃度升高和作用時(shí)間延長而降低。

圖2 TPL對SU-DHL-4凋亡的影響

圖3 TPL對SU-DHL-4凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 增殖相關(guān)蛋白表達(dá) 見圖4。結(jié)果顯示TPL對增殖相關(guān)蛋白AKT、ERK和STAT5及其磷酸化形式的表達(dá)，具有劑量與時(shí)間依賴性下調(diào)作用。

圖4 TPL對SU-DHL-4增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

DLBCL是成人惡性淋巴瘤最常見的類型之一，在形態(tài)學(xué)和臨床表現(xiàn)上均具有顯著的異質(zhì)性，傳統(tǒng)化療藥物治療預(yù)后差，篩選新的能有效殺傷DLBCL細(xì)胞的小分子化合物是近年來研究的熱點(diǎn)。TPL是中草藥雷公藤主要活性成分的提取物，其衍生物PG490-88作為一種水溶性的衍生物，目前已經(jīng)用于黑色素瘤等實(shí)體瘤的一期臨床試驗(yàn)［6］。

本研究結(jié)果顯示，TPL可抑制SU-DHL-4細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞的增殖抑制率明顯增加，凋亡細(xì)胞增多，證實(shí)TPL具有抗DLBCL的活性。分析其作用機(jī)制可能為:①抑制抗凋亡蛋白表達(dá)，活化 Caspase級聯(lián)反應(yīng)［7～14］。本研究結(jié)果顯示，TPL干預(yù)后相關(guān)抗凋亡蛋白XIAP和Mcl-1表達(dá)均呈濃度及時(shí)間依賴性降低;與凋亡密切相關(guān)的Caspase級聯(lián)反應(yīng)中的Pro-caspase8、Procaspase3表達(dá)亦呈濃度和時(shí)間依賴性降低;具有DNA損傷修復(fù)作用的Caspase3的底物PARP呈劑量與時(shí)間依賴性切割。②抑制增殖相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT，MEK/ERK和JAKs/STATs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞增殖、分化及凋亡關(guān)系密切，通路的異?；罨蓪?dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［15～17］，本研究結(jié)果顯示，TPL 干預(yù)后 P-AKT、PERK、P-STAT5表達(dá)水平下調(diào)與其總體蛋白水平的下調(diào)相比發(fā)生較早，提示這些信號通路活化受到TPL的抑制，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制。關(guān)于這些通路是否與細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)直接相關(guān)以及TPL在體抗DLBCL生長的作用如何，還需進(jìn)一步探討與研究。

分析本研究結(jié)果，TPL可通過對凋亡相關(guān)蛋白及PI3K-Akt，MEK/ERK和JAKs/STATs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，抑制SU-DHL-4細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡。本研究為DLBCL的治療提供了新的策略與思路。

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