張文英，郭莉萍，沈廣虎

(1 天津市安定醫(yī)院，天津 300222;2 戴安中國有限公司)

目前在國內(nèi)，氯氮平已廣泛應用于非典型抗精神病的治療，其鎮(zhèn)靜作用強，具有強大的抗精神病效應，對精神病陽性和陰性癥狀均有良好的療效，且較少引起錐體外系反應［1］。所以對患者服用氯氮平后體內(nèi)的血藥濃度的監(jiān)測并建立有效快速的血清氯氮平的檢測方法具有現(xiàn)實意義。目前檢測血清中氯氮平的常規(guī)方法是先將血清進行離線預處理，再進行色譜檢測分析，血清的前處理方法非常繁瑣，且屬于有毒作業(yè)，同時離線前處理增加了人為干擾因素，影響結(jié)果的準確性。為此我們建立一種在線固相萃取(SPE)前處理方法檢測血清中的氯氮平，探討其準確性和合理性。

1 材料與方法

1.1 材料 Dionex Ultimate 3000系列(Thermo Fisher);脫氣機:SRD-3600(PN:5035.9230);泵:DPG-3600SD(PN:5040.0061);自動進樣器:WPS-3000SL(PN:5822.0020);柱溫箱:TCC-3200(PN:5722.0035);檢 測 器:DAD-3600(RS)(PN:5082.0020);色譜軟件:Chromeleon Chromatography Data System。氯氮平對照品(湖南洞庭制藥提供，批號20081101 純度 99.9%)，色譜純甲醇(Sigma，批號 MKBH8418V)，色 譜 純 乙 腈 (Sigma，批 號WXBB0245V)，醋酸銨(分析純天津贏達試劑，批號2012914)，超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 分析柱:Acclaim 120 C18，4.6*250 mm，5 μm(PN:059149:SN:004806);SPE 柱:Capcell MF Ph-1，4.0 ×10(資生堂，12416 guard cartridge);流動相:H2O(100 mM NH4Ac)、乙腈;柱溫:30℃;進樣量:100 μL;流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm。

1.2.2 梯度條件 見表1。

1.2.3 氯氮平儲備液及工作液的配制 精確稱取50 mg氯氮平對照品溶于50 mL甲醇中制成1 mg/mL的儲備液，用甲醇將儲備液分別稀釋成濃度為1～80 μg/mL的工作液。

1.3.4 樣本預處理 將標準血清或患者血清10000 r/min離心10 min，取上清直接上機進樣。

表1 SPE柱及分析柱梯度條件

2 結(jié)果

2.1 專屬性實驗 在本實驗條件下，不同濃度血清氯氮平對照品的色譜圖見圖1。由圖1可知，標準品氯氮平的色譜峰能完全分離，沒有明顯的內(nèi)生雜質(zhì)峰干擾，可見本方法具有較高的專屬性;氯氮平的保留時間為10.783 min。

2.2 標準曲線的制備 將不同濃度的工作液分別加入空白血清中制成濃度為 20、50、100、200、400、800、1600 ng/mL的標準血清樣本，作為外標液。將外標液10000 r/min離心10 min取上清上機進行檢測，以濃度為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y繪制標準曲線，Y=0.0042X，r=0.9997，n=7。最低檢出限1.5 ng/mL(S/N=3)。見圖 2。

圖1 不同濃度氯氮平標準血清色譜圖

圖2 不同濃度的標準血清制成的標準曲線

2.3 精密度實驗 取氯氮平低、中、高濃度(50、200、800 ng/mL)含藥血清樣本，重復檢測5次為1批次，再重復測定4批次，色譜分析所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析計算其批內(nèi)和批間的精密度見表2。

2.4 回收率 取氯氮平低、中、高濃度(50、200、800 ng/mL)含藥血清樣本，1 d內(nèi)重復檢測5次，色譜分析所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析，得到回收率和回收RSD見表3。

表2 在線前處理法測定氯氮平批內(nèi)批間精密度(n=5)

表3 在線前處理法測定氯氮平的方法回收率(%)

3 討論

目前氯氮平作為精神科的常用藥物已廣泛應用于臨床。臨床上對氯氮平的檢測均采用254 nm紫外吸收波長［2］，故本試驗亦采用254 nm波長檢測。傳統(tǒng)血清藥物濃度測定方法均需對待測樣本進行離線預處理。傳統(tǒng)預處理方法主要包括去蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。有研究顯示，相比前兩種預處理方法，固相萃取法操作更簡單、用時少，通過比較同一血漿提取后的含量測定色譜圖［3］，可見經(jīng)固相萃取的樣本雜質(zhì)明顯減少，因此可減輕對色譜柱的影響，延長其使用壽命［4，5］。但離線預處理過程中會造成提取率不穩(wěn)定，而且操作繁瑣，增加了人為干擾因素，且有機溶劑對工作人員造成傷害。

本研究采用在線SPE樣本預處理，該方法自動化程度高，且避免了人為干擾因素，批內(nèi)批間RSD均＜2%。在許多文獻［2］中顯示，采用離線預處理方法檢測氯氮平其批內(nèi)批間RSD為5%～7%，甚至接近10%，在線前處理分析所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，其精密度及回收率均符合生物樣品分析要求，且其精密度有很大提高［5］。總之，該方法操作簡便、快速、精確，可大批量檢測臨床樣本，滿足臨床藥物濃度監(jiān)測需要。

［1］陳新謙.新編藥物學［M］.16版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:272.

［2］劉偉忠，陳清霞，黃偉僑，等.高效液相色譜法同時測定人血漿中氯氮平與氟西汀的濃度［J］.廣東藥學院學報，2011，27(3):243-246.

［3］梅艷，宋新文，汪洋.固相萃取高效液相色譜法測定氯氮平血藥濃度［J］.中國臨床藥理學雜志，2012，28(6):456-457.

［4］李冬梅，丁學開，梁民琦，等.固相萃取用于血漿中抗癲癇藥物的提取［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，1999，6(16):132-134.

［5］魚愛和，劉平，范武峰，等.測定氯氮平血藥濃度臨床意義的探討［J］.中國臨床藥理學雜志，1994，10(1):27-31.