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        在線固相萃取——高效液相色譜法檢測人血清中氯氮平濃度

        2013-09-05 05:07:02張文英郭莉萍沈廣虎
        山東醫(yī)藥 2013年19期
        關(guān)鍵詞:氯氮平氯氮離線

        張文英,郭莉萍,沈廣虎

        (1 天津市安定醫(yī)院,天津 300222;2 戴安中國有限公司)

        目前在國內(nèi),氯氮平已廣泛應用于非典型抗精神病的治療,其鎮(zhèn)靜作用強,具有強大的抗精神病效應,對精神病陽性和陰性癥狀均有良好的療效,且較少引起錐體外系反應[1]。所以對患者服用氯氮平后體內(nèi)的血藥濃度的監(jiān)測并建立有效快速的血清氯氮平的檢測方法具有現(xiàn)實意義。目前檢測血清中氯氮平的常規(guī)方法是先將血清進行離線預處理,再進行色譜檢測分析,血清的前處理方法非常繁瑣,且屬于有毒作業(yè),同時離線前處理增加了人為干擾因素,影響結(jié)果的準確性。為此我們建立一種在線固相萃取(SPE)前處理方法檢測血清中的氯氮平,探討其準確性和合理性。

        1 材料與方法

        1.1 材料 Dionex Ultimate 3000系列(Thermo Fisher);脫氣機:SRD-3600(PN:5035.9230);泵:DPG-3600SD(PN:5040.0061);自動進樣器:WPS-3000SL(PN:5822.0020);柱溫箱:TCC-3200(PN:5722.0035);檢 測 器:DAD-3600(RS)(PN:5082.0020);色譜軟件:Chromeleon Chromatography Data System。氯氮平對照品(湖南洞庭制藥提供,批號20081101 純度 99.9%),色譜純甲醇(Sigma,批號 MKBH8418V),色 譜 純 乙 腈 (Sigma,批 號WXBB0245V),醋酸銨(分析純天津贏達試劑,批號2012914),超純水。

        1.2 方法

        1.2.1 色譜條件 分析柱:Acclaim 120 C18,4.6*250 mm,5 μm(PN:059149:SN:004806);SPE 柱:Capcell MF Ph-1,4.0 ×10(資生堂,12416 guard cartridge);流動相:H2O(100 mM NH4Ac)、乙腈;柱溫:30℃;進樣量:100 μL;流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm。

        1.2.2 梯度條件 見表1。

        1.2.3 氯氮平儲備液及工作液的配制 精確稱取50 mg氯氮平對照品溶于50 mL甲醇中制成1 mg/mL的儲備液,用甲醇將儲備液分別稀釋成濃度為1~80 μg/mL的工作液。

        1.3.4 樣本預處理 將標準血清或患者血清10000 r/min離心10 min,取上清直接上機進樣。

        表1 SPE柱及分析柱梯度條件

        2 結(jié)果

        2.1 專屬性實驗 在本實驗條件下,不同濃度血清氯氮平對照品的色譜圖見圖1。由圖1可知,標準品氯氮平的色譜峰能完全分離,沒有明顯的內(nèi)生雜質(zhì)峰干擾,可見本方法具有較高的專屬性;氯氮平的保留時間為10.783 min。

        2.2 標準曲線的制備 將不同濃度的工作液分別加入空白血清中制成濃度為 20、50、100、200、400、800、1600 ng/mL的標準血清樣本,作為外標液。將外標液10000 r/min離心10 min取上清上機進行檢測,以濃度為橫坐標X,以峰面積為縱坐標Y繪制標準曲線,Y=0.0042X,r=0.9997,n=7。最低檢出限1.5 ng/mL(S/N=3)。見圖 2。

        圖1 不同濃度氯氮平標準血清色譜圖

        圖2 不同濃度的標準血清制成的標準曲線

        2.3 精密度實驗 取氯氮平低、中、高濃度(50、200、800 ng/mL)含藥血清樣本,重復檢測5次為1批次,再重復測定4批次,色譜分析所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析計算其批內(nèi)和批間的精密度見表2。

        2.4 回收率 取氯氮平低、中、高濃度(50、200、800 ng/mL)含藥血清樣本,1 d內(nèi)重復檢測5次,色譜分析所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析,得到回收率和回收RSD見表3。

        表2 在線前處理法測定氯氮平批內(nèi)批間精密度(n=5)

        表3 在線前處理法測定氯氮平的方法回收率(%)

        3 討論

        目前氯氮平作為精神科的常用藥物已廣泛應用于臨床。臨床上對氯氮平的檢測均采用254 nm紫外吸收波長[2],故本試驗亦采用254 nm波長檢測。傳統(tǒng)血清藥物濃度測定方法均需對待測樣本進行離線預處理。傳統(tǒng)預處理方法主要包括去蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。有研究顯示,相比前兩種預處理方法,固相萃取法操作更簡單、用時少,通過比較同一血漿提取后的含量測定色譜圖[3],可見經(jīng)固相萃取的樣本雜質(zhì)明顯減少,因此可減輕對色譜柱的影響,延長其使用壽命[4,5]。但離線預處理過程中會造成提取率不穩(wěn)定,而且操作繁瑣,增加了人為干擾因素,且有機溶劑對工作人員造成傷害。

        本研究采用在線SPE樣本預處理,該方法自動化程度高,且避免了人為干擾因素,批內(nèi)批間RSD均<2%。在許多文獻[2]中顯示,采用離線預處理方法檢測氯氮平其批內(nèi)批間RSD為5%~7%,甚至接近10%,在線前處理分析所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理,其精密度及回收率均符合生物樣品分析要求,且其精密度有很大提高[5]。總之,該方法操作簡便、快速、精確,可大批量檢測臨床樣本,滿足臨床藥物濃度監(jiān)測需要。

        [1]陳新謙.新編藥物學[M].16版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:272.

        [2]劉偉忠,陳清霞,黃偉僑,等.高效液相色譜法同時測定人血漿中氯氮平與氟西汀的濃度[J].廣東藥學院學報,2011,27(3):243-246.

        [3]梅艷,宋新文,汪洋.固相萃取高效液相色譜法測定氯氮平血藥濃度[J].中國臨床藥理學雜志,2012,28(6):456-457.

        [4]李冬梅,丁學開,梁民琦,等.固相萃取用于血漿中抗癲癇藥物的提取[J].中國現(xiàn)代應用藥學,1999,6(16):132-134.

        [5]魚愛和,劉平,范武峰,等.測定氯氮平血藥濃度臨床意義的探討[J].中國臨床藥理學雜志,1994,10(1):27-31.

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