郝更新，曹文紅，郝記明，章超樺，*

(1.中國(guó)科學(xué)院南海海研究所，廣東廣州510301;2.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門361021;3.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049;4.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524025)

牡蠣是四大養(yǎng)殖貝類之一，目前我國(guó)已成為世界上牡蠣養(yǎng)殖大國(guó)，年產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了35.0萬(wàn)t，其中福建為14.5萬(wàn)t［1］。國(guó)內(nèi)對(duì)牡蠣的利用仍然以鮮食和干制品為主，少量加工成蠔油或其它調(diào)味品，對(duì)其深加工的研究相對(duì)較少，附加值較低。牡蠣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高，以干基計(jì)，蛋白質(zhì)(39.1%～53.1%)，脂肪(7.8%～8.7%)，糖原(21.6%～38.9%)［2］。同時(shí)，牡蠣是我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)的第一批藥用兼保健的功能性食品，已有許多學(xué)者對(duì)其展開活性成分的提取和分析研究。然而水產(chǎn)動(dòng)物蛋白作為主要的營(yíng)養(yǎng)成分往往是沒(méi)有生物活性的，需要在消化過(guò)程中產(chǎn)生活性，也可以作為前體蛋白水解制備生物活性肽［3］。利用蛋白酶制備生物活性肽就是其中之一。盡管可以通過(guò)酶解工藝的優(yōu)化獲得分子質(zhì)量相對(duì)較為集中的組分，但是蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小、組成、結(jié)構(gòu)等方面的多樣性和復(fù)雜性不可避免地將導(dǎo)致蛋白質(zhì)酶解液的成分復(fù)雜多樣。因此，尋找經(jīng)濟(jì)合理分離富集牡蠣蛋白酶解液中的小分子活性肽的方法就成為技術(shù)關(guān)鍵。超濾法由于可以按膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量(MWCO)對(duì)物料進(jìn)行分離，用于蛋白質(zhì)制品的純化具有工藝流程短、耗用化學(xué)試劑少、操作簡(jiǎn)單、成本低、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的推廣潛力［4］。本研究通過(guò)超濾工藝對(duì)牡蠣貝肉蛋白酶解液進(jìn)行處理，分離富集抗氧化活性肽，同時(shí)為超濾技術(shù)分離純化其它生物活性肽提供參考。

表1 超濾對(duì)清除自由基活性的影響Table 1 Scavenging activity of ultrafiltration against free radicals

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牡蠣 廈門集美人人樂(lè)購(gòu)物廣場(chǎng)，塑料袋分裝，－18℃保存;葡聚糖凝膠(Sephadex)G－25 Sigma公司。

UV－5200型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;日立835－50型高速氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;SCM杯式超濾系統(tǒng) 上海斯納普膜分離科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣酶解液的制備 新鮮牡蠣洗凈，按料水比1∶3(mg∶mL)加入預(yù)冷的蒸餾水，高速勻漿后加入中性蛋白酶，加酶量為1500U/g底物，于43.7℃恒溫水浴酶解 225min，酶解結(jié)束后 100℃水浴滅酶15min，冷卻，再以 4000r/min，離心 10min，取上清液分裝，即得牡蠣酶解液，冷藏備用。

1.2.2 牡蠣酶解液的膜分離 使用截留分子量為10000u的聚醚砜超濾膜對(duì)牡蠣酶解液進(jìn)行超濾處理，將可溶性物質(zhì)分為 ＞10000u和 ＜10000u兩部分;再使用截留分子量為4000u的聚醚砜超濾膜對(duì)＜10000u的超濾液進(jìn)行超濾處理，又可分成4000～10000u和＜4000u兩部分。超濾后的各組分的可溶性蛋白濃度采用Folin－酚法測(cè)定。

1.2.3 數(shù)據(jù)測(cè)定 分別測(cè)定羥自由基清除率［5］、DPPH 自由基清除率［6］、超氧陰離子清除率［7］、抑制肝脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)驗(yàn)［8］、還原力［9］，并對(duì)氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定［10］。

1.2.4 超濾液分子量分析 超濾液分子質(zhì)量的測(cè)定采用葡聚糖凝膠柱層析法。采用牛血清白蛋白(MW67000u)、抑 肽 酶 (MW6500u)、桿 菌 肽(MW1450u)和L－酪氨酸(MW181u)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。凝膠層析條件:凝膠類型:葡聚糖凝膠(Sephadex)G－25;凝膠柱的規(guī)格:16mm(內(nèi)徑)×90cm(長(zhǎng));洗脫液:雙重蒸餾水;收集方法:SBS－100－LCD型自動(dòng)部分收集器;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。

4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合物經(jīng)分離后，以各管在280nm的吸光值為縱坐標(biāo)，以洗脫液收集管數(shù)為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)肽洗脫體積。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)肽洗脫流速求出各標(biāo)準(zhǔn)肽的洗脫體積(Ve)，然后制作標(biāo)準(zhǔn)肽的相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)(x)與洗脫體積(y)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=－38.653x+255.77，R2=0.956。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同組分對(duì)各種自由基的清除效果

羥自由基是體內(nèi)最具活性的自由基，主要來(lái)源于超氧自由基，過(guò)氧化氫，脂質(zhì)、蛋白和核酸等生物大分子的氧化［11］。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，即使在室溫下也很穩(wěn)定，它可以接受一個(gè)電子或是一個(gè)氫根離子變成一個(gè)穩(wěn)定的分子［12］。超氧陰離子是體內(nèi)最常見的自由基，它是氧分子通過(guò)接受一個(gè)電子后的復(fù)位形式。雖然超氧陰離子活性不高，但是它能通過(guò)歧化和其他反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫和氫自由基，是體內(nèi)自由基的來(lái)源，它可以殺死細(xì)胞，使酶失活，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖［13］。生物細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化被認(rèn)為是需氧生物遇到氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞受損的主要機(jī)制之一。自由基攻擊肝脂質(zhì)膜中不飽和脂肪酸的雙鍵，造成脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞器和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變并引發(fā)功能障礙。同時(shí)，它也為體內(nèi)進(jìn)一步的過(guò)氧化反應(yīng)連續(xù)不斷地提供自由基［14］。在本研究中將上述自由基作為研究抗氧化活性的指標(biāo)，由表1可知，＜10000u的2個(gè)超濾液組分與原液相比清除這些自由基的能力均有所提高;其中，＜4000u超濾液對(duì)這些自由基的清除效果最好，且與原液和＞10000u的組分均存在著顯著性差異(p＜0.05)。

還原力是衡量抗氧化劑供電子能力的指標(biāo)。由圖1可知，原液和各超濾組分的還原力都是隨著濃度的增加而增加，且相同的濃度下的＜4000u超濾液的還原力最高，其次是4000～10000u超濾液、原液和＞10000u超濾液。

圖1 超濾對(duì)還原力的影響Fig.1 The effect of ultrafiltration on reducing power

表2 氨基酸組成(mmol/mL)Table 2 Amino acid composition(mmol/mL)

表3 超濾液中各組分的分子量分布及羥自由基清除活性Table 3 Distribution of MW and Hydroxyl radical scavenging activity of ultrafiltrate

類似地，劉成梅等［15］對(duì)羅非魚魚皮蛋白酶解液進(jìn)行超濾處理，0.80mg/mL超濾液和0.03mg/mL抗壞血酸清除H2O2的能力相當(dāng);李琳等［16］采用連續(xù)串聯(lián)超濾技術(shù)對(duì)鳙魚蛋白酶解物進(jìn)行分離，56.7%的肽段留在此濾過(guò)液中，且濾過(guò)物的抗氧化活性強(qiáng)于原酶解液;Zhou等［17］利用超濾膜截流玉米蛋白的中性蛋白酶酶解液得到的4個(gè)組分中以分子量為1～3ku的組分抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的活性最強(qiáng)。諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，超濾處理對(duì)大多數(shù)具有較強(qiáng)活性的肽段有濃縮作用。

2.2 氨基酸分析

抗氧化肽的活性與氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和疏水性密切相關(guān)［18］。酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸等氨基酸可引起抗氧化活性［19］。芳香族氨基酸可以為失電子的自由基提供電子［20］。含有組氨酸的肽，其抗氧化活性與提供氫離子、吸附脂質(zhì)過(guò)氧化氫自由基和咪唑基的螯合能力有關(guān)［21］。半胱氨酸的巰基由于可以直接與自由基作用因而具有抗氧化活性［22］。一般，富含組氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的肽鏈可能具有較高的抗氧化活性［3］。根據(jù)表2數(shù)據(jù)計(jì)算上述7種氨基酸在各自樣品中的含量，在原液和＜4000u的超濾液中分別為18.1%和21.2%，說(shuō)明這些氨基酸經(jīng)過(guò)超濾處理有了一定的富集。前面的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)超濾處理抗氧化活性的提高，具有活性的物質(zhì)得到了濃縮，這可能與這些氨基酸含量的升高有關(guān)。

2.3 凝膠層析

凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)分離物質(zhì)分子量大小不同而達(dá)到分離效果的一種色譜方法。將＜4000u超濾液上柱分離，在280nm處測(cè)定接收液吸光度，繪制洗脫曲線，見圖2。由圖2可以看出，層析圖譜上有4個(gè)明顯的洗脫峰。組分1洗脫峰出現(xiàn)在洗脫開始第46管左右的收集液中，組分2洗脫峰出現(xiàn)在洗脫開始第57管左右的收集液中，組分3洗脫峰出現(xiàn)在洗脫開始第68管左右的收集液中，組分4洗脫峰出現(xiàn)在洗脫開始第77管左右的收集液中，且各組分沒(méi)有重疊，說(shuō)明Sephadex G－25柱層析可將各組分分離。由于組分3和組分4無(wú)法測(cè)出可溶性蛋白，而且根據(jù)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其分子量極低，可知它們?yōu)殡s峰，因此不予以考察。分別合并39至50管，51管至62管。根據(jù)回歸方程計(jì)算得各組分的分子量范圍，測(cè)定可溶性蛋白濃度，檢測(cè)羥自由基清除活性求IC50值，如表3所示。由表3可知，超濾液的組分1對(duì)羥自由基清除活性的IC50值為13.59mg/mL，占超濾液的39.59%，主要是一些小分子蛋白質(zhì)和肽類。超濾液的組分2對(duì)羥自由基清除活性的 IC50值為20.82mg/mL，占超濾液的26.12%，主要是一些肽類和氨基酸。

圖2 超濾液的Sephadex G－25凝膠過(guò)濾洗脫曲線Fig.2 Elution curve of enzymatic hydrolysate with gel filtration on Sephadex G－25

3 結(jié)論

牡蠣蛋白酶解液經(jīng)超濾處理后，具有抗氧化能力的組分得到了濃縮?？赡艿脑蚴浅瑸V后組氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等對(duì)抗氧化肽活性影響較大的七種氨基酸的含量得到了富集。＜4000u的超濾液經(jīng)Sephadex G－25分離及分子量分析，結(jié)果表明具有抗氧化活性的部分主要集中在550～3890u。經(jīng)超濾處理后的牡蠣蛋白酶解液仍為混合物，建議下一步工作應(yīng)分離并收集一系列單體化合物，以便專門研究結(jié)構(gòu)與構(gòu)效關(guān)系，對(duì)抗氧化能力較高的肽段氨基酸序列作進(jìn)一步分析和研究。

［1］農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局.中國(guó)漁業(yè)年鑒［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010:175.

［2］Linehan LG，O’Connor TP，Burnell G.Seasonal variation in the chemical composition and fatty acid profile of Pacific oysters(Crassostrea gigas)［J］.Food Chemistry，1999，64(2):211－214.

［3］Chalamaiah M，Kumar BD，Hemalatha R，et al.Fish protein hydrolysates:proximate composition，amino acid composition，antioxidant activities and applications:a review［J］.Food Chemistry，2012，135(4):3020－3038.

［4］Castel V，Andrich O，Netto FM，et al.Comparison between isoelectric precipitation and ultrafiltration processes to obtain Amaranth mantegazzianus protein concentrates at pilot plant scale［J］.Journal of Food Engineering，2012，112(4):288－295.

［5］Li Y，Jiang B，Zhang T，et al.Antioxidant and free radicalscavenging activities of chickpea protein hydrolysate(CPH)［J］.Food Chemistry，2008，106(2):444－450.

［6］Wu HC，Chen HM，Shiau CY.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel(Scomber austriasicus)［J］.Food Research International，2003，36:949－957.

［7］Sánchez－Moreno C，Larrauri JA，Saura－Calixto F.Free radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxidation of wines，grape juices and related polyphenolic constituents［J］.Food Research International，1999，32(6):407－412.

［8］Srivastava A，Harish SR，Shivanandappa T.Antioxidant activity of the roots of Decalepis hamiltonii(Wight＆ Arn.)［J］.LWT－Food Science and Technology，2006，39(10):1059－1065.

［9］張澤生，賀偉，劉甜甜，等.白藜蘆醇的體外抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2012，33(11):266－268.

［10］郝更新，章超樺，曹文紅.蝦頭內(nèi)源酶酶解物的ACE抑制活性分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(12):20－22.

［11］Sasipriya G，Siddhuraju P.Effect of different processing methods on antioxidant activity of underutilized legumes，Entada scandens seed kernel and Canavalia gladiata seeds［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50:2864－2872.

［12］O’Sullivan AM，O’Callaghan YC，O’Grady MN，et al.In vitro and cellular antioxidant activitiesofseaweed extracts prepared from five brown seaweeds harvested in spring from the west coast of Ireland［J］.Food Chemistry，2011，126:1064－1070.

［13］Sasipriya G，Siddhuraju P.Effect of different processing methods on antioxidant activity of underutilized legumes，Entada scandens seed kernel and Canavalia gladiata seeds［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50:2864－2872

［14］Adefegha SA，Oboh G.In vitro inhibition activity of polyphenol－ rich extracts from Syzygium aromaticum(L.)Merr.＆Perry(Clove)buds against carbohydrate hydrolyzing enzymes linked to type 2 diabetes and Fe2+－induced lipid peroxidation in rat pancreas［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine，2012，2:774－781.

［15］劉成梅，梁漢縈，劉偉，等.羅非魚魚皮多肽的超濾分離及其抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(5):227－230.

［16］李琳，趙謀明，孫莉娜.連續(xù)串聯(lián)超濾對(duì)鳙魚酶解物抗氧化活性的影響［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2009，9(5):29－34.

［17］Zhou K，Sun S，Canning C.Production and functional characterisation of antioxidative hydrolysates from corn protein via enzymatic hydrolysis and ultrafiltration［J］.Food Chemistry，2012，135(3):1192－1197.

［18］Chen HM，Muramoto K，Yamauchi F，et al.Antioxidative properties of histidine－containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46:49－53.

［19］Wang WY，De Mejia EG.A new frontier in soy bioactive peptides that may preventage － related chronic diseases［J］.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2005，4:63－78.

［20］Rajapakse N，Mendis E，Jung WK，et al.Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties［J］.Food Research International，2005，38:175－182.

［21］Chan KM，DeckerEA.Endogenousskeletalmuscle antioxidants［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1994，34:403－426.

［22］Qian ZJ，Jung WK，Kim SK.Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin，Rana catesbeiana Shaw［J］.Bioresource Technology，2008，99:1690－1698.