姚 軍，何曉文，李新霞，*，張煌濤，鹿 毅

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊830054;2.新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，新疆烏魯木齊830054)

棉酚(gossypol)，又稱棉毒素或棉籽醇，是一種存在于錦葵科植物成熟種子中的黃色多羥基雙萘醛化合物，可引起嚴(yán)重的低鉀血癥［1－2］和男性不可逆不育［3－4］，分子式為 C30H30O8。棉酚的分子結(jié)構(gòu)中有一個手性軸，產(chǎn)生有左旋(－)－棉酚和右旋(+)－棉酚兩種位阻光學(xué)異構(gòu)體，天然棉酚一般以外消旋體(±)－棉酚的混合形式存在，見圖1。近年來研究表明，(－)－棉酚表現(xiàn)出更強的毒副作用［5－6］，其中抗生精作用是(+)－棉酚的十倍，而(+)－棉酚幾乎無活性。新疆是我國棉花的主產(chǎn)區(qū)，棉籽成為當(dāng)?shù)鼐用裰匾挠土腺Y源，副產(chǎn)品棉粕因富含粗蛋白而作為優(yōu)質(zhì)的動物飼料，但棉酚的毒性限制了它的利用。目前，國家規(guī)定了食品和動物飼料中總游離棉酚限量≤0.02%，并制定了相關(guān)的檢測方法［7－8］，國內(nèi)外也有高效液相色譜法［9－10］、毛細(xì)管電泳法［11－12］、化學(xué)發(fā)光法［13］和紅外法［14］等其他文獻(xiàn)報道，主要集中在消旋體棉酚的定量研究，通常樣品基質(zhì)的干擾較大，前處理要求較高。本文在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立一種高效液相－質(zhì)譜法測定棉籽仁中(－)－棉酚和(+)－棉酚含量的檢測方法，該方法專屬性強，靈敏度高，樣品處理簡便易行，適于食品和飼料中(－)和(+)－棉酚的含量測定，為正確評估棉酚的毒性提供一定參考價值。

圖1 (－)－和(+)－棉酚對映異構(gòu)體Fig.1 The stereochemical structure of(－)－and(+)－gossypol

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棉籽 烏魯木齊北園春農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場;(±)－棉酚對照品 (CAS 號 303－45－7，純度≥95%)、R－(－)－2－胺基－1－丙醇(CAS號 35320－23－1，純度98%)美國Sigma公司;乙腈(色譜純)美國Fisher公司;無水甲酸(色譜純)天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;石油醚(沸程30～60℃)、冰醋酸和N、N－二甲基甲酰胺 均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent 1946C質(zhì)譜儀 美國Agilent公司;AB135－S型電子分析天平Mettler－Toledo公司;KQ－500DE型超聲提取儀 昆山市超聲儀器有限公司;DK－S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Milli－Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 (±)－棉酚衍生物儲備液的制備 精密稱取棉酚對照品 19.28mg，溶于含 2%R－(－)－2－胺基－1－丙醇和10%冰醋酸的N，N－二甲基甲酰胺溶液，置90℃下水浴30min，冷卻后定容至100mL棕色容量瓶中，即得濃度為192.8μg/mL的(±)－棉酚衍生物儲備液，于－20℃下避光保存，兩個月內(nèi)使用。臨用時將儲備液稀釋至合適濃度。

1.2.1.2 供試品衍生溶液的制備 將棉籽脫殼取仁，搗碎并過60目篩，取約0.10g，置于具塞三角瓶中，加石油醚10mL，震蕩混勻，室溫下放置2h，過濾，取濾渣，加10%冰醋酸的N，N－二甲基甲酰胺15mL和2%(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇 0.2mL，超聲處理30min;避光放置2h后，置90℃下水浴加熱30min進(jìn)行衍生化反應(yīng)，冷卻后定容至25mL棕色容量瓶中，作為供試品衍生溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

1.2.2 分析條件

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent XDB－C18分析柱(250mm ×4.6mm，5μm);流動相:乙腈∶1.0% 甲酸 =85∶15;流速:1.0mL/min，柱后分流比 15%;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20μL。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI);離子極性:正離子模式(Positive);選擇性離子監(jiān)測(SIM):［M+H］+m/z 633.2;錐孔電壓:90eV;傳輸區(qū)電壓:200V;干燥氣(N2)流速和溫度:8L/min和350℃;霧化室壓力:310kPa;毛細(xì)管電壓:4000V。

2 結(jié)果與討論

棉酚旋光異構(gòu)體的物理化學(xué)性質(zhì)極其相似，在常規(guī)C18色譜柱上的保留行為一致，手性分離的難度較大。本實驗采用的柱前手性衍生化法，是一種間接分離對映體的方法，基本原理是將含醛基的(±)－棉酚與含伯氨的手性拆分試劑作用，轉(zhuǎn)換成非對映異構(gòu)體，然后利用它們在化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)上的差異使之分離。該反應(yīng)是一種酸催化的親核加成反應(yīng)，溶液中微量的氫離子與羰基結(jié)合成金鹽而增加羰基的親電性能;但不能使用強酸，因為過量的氫離子和氨基結(jié)合形成銨離子衍生物，會喪失胺的親核能力［15］，衍生化反應(yīng)方程式，見圖2。

圖2 棉酚與(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇的衍生化反應(yīng)Fig.2 The derivatization of gossypol with(R)－2－Amino－1－propanol

2.1 樣品前處理條件的選擇

2.1.1 提取工藝的優(yōu)化 研究表明，游離棉酚易溶于油脂和中等極性的有機溶劑，不易溶于低沸點的石油醚、己烷和水。由于棉籽仁中含有大量的棉籽油，預(yù)先進(jìn)行脫脂處理，可以提高棉酚的浸出速率;分別用丙酮、氯仿和N，N－二甲基甲酰胺溶液提取棉籽仁中的棉酚(n=3)，總游離棉酚的提取率相差不大;同時，本實驗在提取液中加入10%冰醋酸，可有效地抑制棉酚的催化氧化反應(yīng)，增強棉酚的穩(wěn)定性。本實驗最終采用含10%冰醋酸的N，N－二甲基甲酰胺溶液作為棉酚的提取溶劑，沸點較高，在后期水浴加熱進(jìn)行衍生化反應(yīng)時，無需添加冷凝回流裝置，操作簡便，優(yōu)于丙酮、氯仿等低沸點溶劑。

2.1.2 棉酚衍生化條件的選擇

2.1.2.1 手性拆分試劑的選擇 分別采用(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇［16］，(L)－(－)－2－氨基－3－苯基－1－丙醇［8］和(1R，2R)－2－氨基－1－(4－硝基苯基)－1，3－丙二醇［17－18］作為(± )－棉酚的手性拆分試劑。結(jié)果表明，(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇與棉酚的衍生化程度高，在色譜柱上分離效果較好。

2.1.2.2 衍生化條件的優(yōu)化 以(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇為手性拆分試劑，分別在 70、80、90℃下水浴加熱進(jìn)行衍生化反應(yīng)，結(jié)果表明，棉酚在90℃水浴加熱30min可基本完成衍生化反應(yīng)。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

棉酚衍生物是一個Schiff堿類結(jié)構(gòu)，經(jīng)掃描離子(Scan)監(jiān)測后，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，分子離子峰m/z=633.2具有較高的響應(yīng)值;分別對各質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)錐孔電壓、干燥氣流速對其影響較大，最佳條件分別為90eV和8L/min。

表1 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果(n=6)Table 1 Results of matrix effect(n=6)

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果(n=6)Table 2 Repeatabilities of(－)－and(+)－gossypol(n=6)

2.3 色譜條件的優(yōu)化

分別使用甲醇和乙腈作為有機相洗脫劑，發(fā)現(xiàn)乙腈具有更高的響應(yīng)值和更好的洗脫能力;分別考察0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%等不同比例的甲酸水溶液作為流動相調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)隨著甲酸濃度的增大，質(zhì)譜的響應(yīng)值也隨之增大，色譜峰也有較好的改善，但超過1.0%后變化不是很明顯。綜合考慮，以乙腈∶1.0%甲酸=85∶15作為流動相為宜。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 分別取(±)－棉酚對照品衍生溶液19.3μg/mL和供試品衍生溶液，按“1.2.2項”下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果表明，(－)－和(+)－棉酚的保留時間分別為8.1min和5.0min，對照品與供試品的保留行為一致，無雜質(zhì)峰干擾。因此，該方法專屬性良好，見圖3、圖4。

圖3 (±)－棉酚對照品衍生溶液HPLC－MS色譜圖Fig.3 HPLC－MS chromatogram of(±)－gossypol derivatives

圖4 供試品溶液HPLC－MS色譜圖Fig.4 HPLC－MS chromatogram of cottonseeds

2.4.2 線性與范圍 分別精密吸取(±)－棉酚衍生物儲備液適量，適當(dāng)稀釋，得系列濃度為1.93、4.82、9.64、19.3、28.9、38.6μg/mL 的(±)－棉酚對照品衍生溶液，按“1.2.2項”下進(jìn)樣分析。以(－)－和(+)－棉酚的總峰面積對溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得(±)－棉酚回歸方程 Y=117040X－130518，R2=0.9994(n=6)，在1.93～38.6μg/mL呈良好線性關(guān)系。

通過上述系列濃度(±)－棉酚對照品衍生溶液，以峰面積之比［19］得(－)－棉酚和(+)－棉酚的比例為48.8∶51.2。

2.4.3 檢測限和定量限 取(±)－棉酚對照品衍生溶液，適當(dāng)稀釋，進(jìn)樣測定。當(dāng)信噪比(S/N)為3時，測得(－)－和(+)－棉酚衍生物的檢測限(LOD)分別為2.52ng/mL和3.41ng/mL;當(dāng)信噪比(S/N)為10時，測得(－)－和(+)－棉酚衍生物的定量限(LOQ)分別為8.39ng/mL和11.4ng/mL。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 精密稱取棉籽仁粉0.05g(7份)，一份留作空白本底，另外六份各加入(±)－棉酚對照品衍生溶液1.0mL作為質(zhì)控樣品，按“1.2.2項”下進(jìn)樣分析，分別記錄相應(yīng)峰面積。以加標(biāo)樣品色譜峰峰面積減去空白本底峰面積的差值，與對照品色譜峰峰面積的比值計算基質(zhì)效應(yīng)，均在85%～115%之間［20］，結(jié)果見表1。因此，認(rèn)為該條件下的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，樣品前處理過程除雜較干凈。

2.4.5 重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性實驗 精密稱取棉籽仁粉約0.10g(6份)，結(jié)果(－)－和(+)－棉酚含量的RSD分別為3.60%和2.87%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表2;取同一供試品衍生溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的RSD分別為1.57%和1.15%(n=6)，表明精密度良好;分別于室溫下 0、2、4、6、8、12h進(jìn)行測定，含量的RSD分別為2.33%和1.75%，表明供試品衍生溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 回收率實驗 精密稱取棉籽仁粉0.05g(12份)，每組三份，其中一組樣品留作空白本底，另外三組按低、中、高三個水平分別加入(±)－棉酚對照品衍生溶液0.2、1.0、3.0mL，分別計算(±)－棉酚中(－)和(+)－棉酚的回收率，結(jié)果見表3。

2.5 樣品含量測定

采用本方法對烏魯木齊市售的6批棉籽進(jìn)行檢測，結(jié)果(－)－棉酚含量為2.83～4.09mg/g，(+)－棉酚含量約為4.13～5.69mg/g，比例約為1∶1.45，結(jié)果見表4。

表3 (－)－和(+)－棉酚回收率實驗結(jié)果(n=3)Table 3 Recoveries of(±)－gossypol at three spike levels(n=3)

表4 樣品測定結(jié)果(n=3)Table 4 Contents of(－)－and(+)－gossypol in samples determined by the method(n=3)

3 結(jié)論

本實驗采用高效液相－質(zhì)譜法測定棉籽仁中左旋和右旋棉酚的含量，在樣品前處理方法、質(zhì)譜條件和色譜條件等方面進(jìn)行優(yōu)化，實驗結(jié)果表明，新疆地區(qū)的棉籽仁中左旋棉酚的含量低于右旋棉酚，兩者的比例約為1∶1.38～1.54。該方法專屬性強，靈敏度高，樣品處理簡便易行，適于食品和飼料中(－)和(+)－棉酚的含量測定。

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