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        高效液相色譜-質(zhì)譜法測定棉籽仁中左旋和右旋棉酚含量

        2013-09-04 10:22:14何曉文李新霞張煌濤
        食品工業(yè)科技 2013年19期
        關(guān)鍵詞:棉酚丙醇胺基

        姚 軍,何曉文,李新霞,*,張煌濤,鹿 毅

        (1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,新疆烏魯木齊830054;2.新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,新疆烏魯木齊830054)

        棉酚(gossypol),又稱棉毒素或棉籽醇,是一種存在于錦葵科植物成熟種子中的黃色多羥基雙萘醛化合物,可引起嚴(yán)重的低鉀血癥[1-2]和男性不可逆不育[3-4],分子式為 C30H30O8。棉酚的分子結(jié)構(gòu)中有一個手性軸,產(chǎn)生有左旋(-)-棉酚和右旋(+)-棉酚兩種位阻光學(xué)異構(gòu)體,天然棉酚一般以外消旋體(±)-棉酚的混合形式存在,見圖1。近年來研究表明,(-)-棉酚表現(xiàn)出更強的毒副作用[5-6],其中抗生精作用是(+)-棉酚的十倍,而(+)-棉酚幾乎無活性。新疆是我國棉花的主產(chǎn)區(qū),棉籽成為當(dāng)?shù)鼐用裰匾挠土腺Y源,副產(chǎn)品棉粕因富含粗蛋白而作為優(yōu)質(zhì)的動物飼料,但棉酚的毒性限制了它的利用。目前,國家規(guī)定了食品和動物飼料中總游離棉酚限量≤0.02%,并制定了相關(guān)的檢測方法[7-8],國內(nèi)外也有高效液相色譜法[9-10]、毛細(xì)管電泳法[11-12]、化學(xué)發(fā)光法[13]和紅外法[14]等其他文獻(xiàn)報道,主要集中在消旋體棉酚的定量研究,通常樣品基質(zhì)的干擾較大,前處理要求較高。本文在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,建立一種高效液相-質(zhì)譜法測定棉籽仁中(-)-棉酚和(+)-棉酚含量的檢測方法,該方法專屬性強,靈敏度高,樣品處理簡便易行,適于食品和飼料中(-)和(+)-棉酚的含量測定,為正確評估棉酚的毒性提供一定參考價值。

        圖1 (-)-和(+)-棉酚對映異構(gòu)體Fig.1 The stereochemical structure of(-)-and(+)-gossypol

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        棉籽 烏魯木齊北園春農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場;(±)-棉酚對照品 (CAS 號 303-45-7,純度≥95%)、R-(-)-2-胺基-1-丙醇(CAS號 35320-23-1,純度98%)美國Sigma公司;乙腈(色譜純)美國Fisher公司;無水甲酸(色譜純)天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;石油醚(沸程30~60℃)、冰醋酸和N、N-二甲基甲酰胺 均為分析純。

        Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent 1946C質(zhì)譜儀 美國Agilent公司;AB135-S型電子分析天平Mettler-Toledo公司;KQ-500DE型超聲提取儀 昆山市超聲儀器有限公司;DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 溶液的配制

        1.2.1.1 (±)-棉酚衍生物儲備液的制備 精密稱取棉酚對照品 19.28mg,溶于含 2%R-(-)-2-胺基-1-丙醇和10%冰醋酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液,置90℃下水浴30min,冷卻后定容至100mL棕色容量瓶中,即得濃度為192.8μg/mL的(±)-棉酚衍生物儲備液,于-20℃下避光保存,兩個月內(nèi)使用。臨用時將儲備液稀釋至合適濃度。

        1.2.1.2 供試品衍生溶液的制備 將棉籽脫殼取仁,搗碎并過60目篩,取約0.10g,置于具塞三角瓶中,加石油醚10mL,震蕩混勻,室溫下放置2h,過濾,取濾渣,加10%冰醋酸的N,N-二甲基甲酰胺15mL和2%(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇 0.2mL,超聲處理30min;避光放置2h后,置90℃下水浴加熱30min進(jìn)行衍生化反應(yīng),冷卻后定容至25mL棕色容量瓶中,作為供試品衍生溶液,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

        1.2.2 分析條件

        1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent XDB-C18分析柱(250mm ×4.6mm,5μm);流動相:乙腈∶1.0% 甲酸 =85∶15;流速:1.0mL/min,柱后分流比 15%;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20μL。

        1.2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI);離子極性:正離子模式(Positive);選擇性離子監(jiān)測(SIM):[M+H]+m/z 633.2;錐孔電壓:90eV;傳輸區(qū)電壓:200V;干燥氣(N2)流速和溫度:8L/min和350℃;霧化室壓力:310kPa;毛細(xì)管電壓:4000V。

        2 結(jié)果與討論

        棉酚旋光異構(gòu)體的物理化學(xué)性質(zhì)極其相似,在常規(guī)C18色譜柱上的保留行為一致,手性分離的難度較大。本實驗采用的柱前手性衍生化法,是一種間接分離對映體的方法,基本原理是將含醛基的(±)-棉酚與含伯氨的手性拆分試劑作用,轉(zhuǎn)換成非對映異構(gòu)體,然后利用它們在化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)上的差異使之分離。該反應(yīng)是一種酸催化的親核加成反應(yīng),溶液中微量的氫離子與羰基結(jié)合成金鹽而增加羰基的親電性能;但不能使用強酸,因為過量的氫離子和氨基結(jié)合形成銨離子衍生物,會喪失胺的親核能力[15],衍生化反應(yīng)方程式,見圖2。

        圖2 棉酚與(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇的衍生化反應(yīng)Fig.2 The derivatization of gossypol with(R)-2-Amino-1-propanol

        2.1 樣品前處理條件的選擇

        2.1.1 提取工藝的優(yōu)化 研究表明,游離棉酚易溶于油脂和中等極性的有機溶劑,不易溶于低沸點的石油醚、己烷和水。由于棉籽仁中含有大量的棉籽油,預(yù)先進(jìn)行脫脂處理,可以提高棉酚的浸出速率;分別用丙酮、氯仿和N,N-二甲基甲酰胺溶液提取棉籽仁中的棉酚(n=3),總游離棉酚的提取率相差不大;同時,本實驗在提取液中加入10%冰醋酸,可有效地抑制棉酚的催化氧化反應(yīng),增強棉酚的穩(wěn)定性。本實驗最終采用含10%冰醋酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液作為棉酚的提取溶劑,沸點較高,在后期水浴加熱進(jìn)行衍生化反應(yīng)時,無需添加冷凝回流裝置,操作簡便,優(yōu)于丙酮、氯仿等低沸點溶劑。

        2.1.2 棉酚衍生化條件的選擇

        2.1.2.1 手性拆分試劑的選擇 分別采用(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇[16],(L)-(-)-2-氨基-3-苯基-1-丙醇[8]和(1R,2R)-2-氨基-1-(4-硝基苯基)-1,3-丙二醇[17-18]作為(± )-棉酚的手性拆分試劑。結(jié)果表明,(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇與棉酚的衍生化程度高,在色譜柱上分離效果較好。

        2.1.2.2 衍生化條件的優(yōu)化 以(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇為手性拆分試劑,分別在 70、80、90℃下水浴加熱進(jìn)行衍生化反應(yīng),結(jié)果表明,棉酚在90℃水浴加熱30min可基本完成衍生化反應(yīng)。

        2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        棉酚衍生物是一個Schiff堿類結(jié)構(gòu),經(jīng)掃描離子(Scan)監(jiān)測后,發(fā)現(xiàn)在正離子模式下,分子離子峰m/z=633.2具有較高的響應(yīng)值;分別對各質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)錐孔電壓、干燥氣流速對其影響較大,最佳條件分別為90eV和8L/min。

        表1 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果(n=6)Table 1 Results of matrix effect(n=6)

        表2 重復(fù)性實驗結(jié)果(n=6)Table 2 Repeatabilities of(-)-and(+)-gossypol(n=6)

        2.3 色譜條件的優(yōu)化

        分別使用甲醇和乙腈作為有機相洗脫劑,發(fā)現(xiàn)乙腈具有更高的響應(yīng)值和更好的洗脫能力;分別考察0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%等不同比例的甲酸水溶液作為流動相調(diào)節(jié)劑,發(fā)現(xiàn)隨著甲酸濃度的增大,質(zhì)譜的響應(yīng)值也隨之增大,色譜峰也有較好的改善,但超過1.0%后變化不是很明顯。綜合考慮,以乙腈∶1.0%甲酸=85∶15作為流動相為宜。

        2.4 方法學(xué)考察

        2.4.1 專屬性考察 分別取(±)-棉酚對照品衍生溶液19.3μg/mL和供試品衍生溶液,按“1.2.2項”下進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,結(jié)果表明,(-)-和(+)-棉酚的保留時間分別為8.1min和5.0min,對照品與供試品的保留行為一致,無雜質(zhì)峰干擾。因此,該方法專屬性良好,見圖3、圖4。

        圖3 (±)-棉酚對照品衍生溶液HPLC-MS色譜圖Fig.3 HPLC-MS chromatogram of(±)-gossypol derivatives

        圖4 供試品溶液HPLC-MS色譜圖Fig.4 HPLC-MS chromatogram of cottonseeds

        2.4.2 線性與范圍 分別精密吸取(±)-棉酚衍生物儲備液適量,適當(dāng)稀釋,得系列濃度為1.93、4.82、9.64、19.3、28.9、38.6μg/mL 的(±)-棉酚對照品衍生溶液,按“1.2.2項”下進(jìn)樣分析。以(-)-和(+)-棉酚的總峰面積對溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,得(±)-棉酚回歸方程 Y=117040X-130518,R2=0.9994(n=6),在1.93~38.6μg/mL呈良好線性關(guān)系。

        通過上述系列濃度(±)-棉酚對照品衍生溶液,以峰面積之比[19]得(-)-棉酚和(+)-棉酚的比例為48.8∶51.2。

        2.4.3 檢測限和定量限 取(±)-棉酚對照品衍生溶液,適當(dāng)稀釋,進(jìn)樣測定。當(dāng)信噪比(S/N)為3時,測得(-)-和(+)-棉酚衍生物的檢測限(LOD)分別為2.52ng/mL和3.41ng/mL;當(dāng)信噪比(S/N)為10時,測得(-)-和(+)-棉酚衍生物的定量限(LOQ)分別為8.39ng/mL和11.4ng/mL。

        2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 精密稱取棉籽仁粉0.05g(7份),一份留作空白本底,另外六份各加入(±)-棉酚對照品衍生溶液1.0mL作為質(zhì)控樣品,按“1.2.2項”下進(jìn)樣分析,分別記錄相應(yīng)峰面積。以加標(biāo)樣品色譜峰峰面積減去空白本底峰面積的差值,與對照品色譜峰峰面積的比值計算基質(zhì)效應(yīng),均在85%~115%之間[20],結(jié)果見表1。因此,認(rèn)為該條件下的基質(zhì)效應(yīng)不明顯,樣品前處理過程除雜較干凈。

        2.4.5 重復(fù)性、精密度及穩(wěn)定性實驗 精密稱取棉籽仁粉約0.10g(6份),結(jié)果(-)-和(+)-棉酚含量的RSD分別為3.60%和2.87%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好,結(jié)果見表2;取同一供試品衍生溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,峰面積的RSD分別為1.57%和1.15%(n=6),表明精密度良好;分別于室溫下 0、2、4、6、8、12h進(jìn)行測定,含量的RSD分別為2.33%和1.75%,表明供試品衍生溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.4.6 回收率實驗 精密稱取棉籽仁粉0.05g(12份),每組三份,其中一組樣品留作空白本底,另外三組按低、中、高三個水平分別加入(±)-棉酚對照品衍生溶液0.2、1.0、3.0mL,分別計算(±)-棉酚中(-)和(+)-棉酚的回收率,結(jié)果見表3。

        2.5 樣品含量測定

        采用本方法對烏魯木齊市售的6批棉籽進(jìn)行檢測,結(jié)果(-)-棉酚含量為2.83~4.09mg/g,(+)-棉酚含量約為4.13~5.69mg/g,比例約為1∶1.45,結(jié)果見表4。

        表3 (-)-和(+)-棉酚回收率實驗結(jié)果(n=3)Table 3 Recoveries of(±)-gossypol at three spike levels(n=3)

        表4 樣品測定結(jié)果(n=3)Table 4 Contents of(-)-and(+)-gossypol in samples determined by the method(n=3)

        3 結(jié)論

        本實驗采用高效液相-質(zhì)譜法測定棉籽仁中左旋和右旋棉酚的含量,在樣品前處理方法、質(zhì)譜條件和色譜條件等方面進(jìn)行優(yōu)化,實驗結(jié)果表明,新疆地區(qū)的棉籽仁中左旋棉酚的含量低于右旋棉酚,兩者的比例約為1∶1.38~1.54。該方法專屬性強,靈敏度高,樣品處理簡便易行,適于食品和飼料中(-)和(+)-棉酚的含量測定。

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