楊薇，周雍進(jìn)，劉武軍，沈宏偉，趙宗保,3

1中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部，遼寧 大連 116023

2營口理工學(xué)院化學(xué)工程系，遼寧 營口 115000

3中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 催化基礎(chǔ)研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023

萜類化合物廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，至今已分離出40余萬種。許多萜類化合物是植物生長、發(fā)育和一般代謝必不可少的化學(xué)物質(zhì)[1]。萜類化合物可應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、香精、香料或農(nóng)藥領(lǐng)域[2]。然而，大多萜類化合物在其天然生產(chǎn)物種中的含量極低，成為制約它們規(guī)模化應(yīng)用的瓶頸。近年來，合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)迅速發(fā)展，為改造目標(biāo)分子的天然生產(chǎn)物種或設(shè)計(jì)異源生產(chǎn)途徑提供了可能[3]。例如，構(gòu)建微生物“細(xì)胞工廠”合成紫穗槐二烯 (青蒿素前體)[4]、紫杉烯 (紅豆杉醇前體)[5]和番茄紅素[6]等萜類化合物，取得了令人振奮的結(jié)果。

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的遺傳背景相對(duì)清晰，遺傳操作平臺(tái)成熟，生物安全性好。由于其甲羥戊酸 (MVA)途徑和異戊二烯(PDP)通路活性高，S.cerevisiae是構(gòu)建萜類化合物異源合成途徑的理想宿主之一。例如，經(jīng)過途徑改造的S.cerevisiae工程菌，合成 (E,E,E)-香葉基香葉醇、(E,E)-法尼醇和丹參酮生物合成前體次丹參酮二烯，產(chǎn)量分別達(dá)到3.31 g/L、145.7 mg/L和488 mg/L[7-10]。此外，異戊二烯合酶亞細(xì)胞定位能增加萜類化合物的合成量[11]。

香紫蘇醇是一種半日花烷型二萜二叔醇，首次在南歐丹參鼠尾草 (Clary sageSalvia sclarea)中發(fā)現(xiàn)，常用于化妝品和香水的香料成分及食品調(diào)味材料。由于其具有很強(qiáng)的抗菌活性及對(duì)真菌生長和植物生長具有調(diào)節(jié)作用，香紫蘇醇也可應(yīng)用于農(nóng)藥領(lǐng)域。此外，香紫蘇醇對(duì)人類白血病細(xì)胞[12]、結(jié)腸癌細(xì)胞[13]及異種移植物[13-14]具有細(xì)胞毒性。目前，大多以植物香紫蘇花序及莖葉為原料提取香紫蘇浸膏，進(jìn)一步純化得到香紫蘇醇。由于香紫蘇生長周期長，且受土地、環(huán)境及氣候因素影響，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。瑞典科研人員發(fā)現(xiàn)了香紫蘇醇合成的兩個(gè)關(guān)鍵酶，焦磷酸賴百當(dāng)烯二醇酯 (LPP)合酶 (SsLPPS)和香紫蘇醇合酶 (SsTPS)，分別催化香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)生成LPP及LPP生成香紫蘇醇的反應(yīng)[15](圖1)。以大腸桿菌為宿主，重組真核生物PDP、MVA途徑及香紫蘇醇的生物合成途徑，結(jié)合高

圖1 釀酒酵母中香紫蘇醇合成策略Fig.1 Schematic diagram of sclareol biosynthesis in S.cerevisiae.Each solid arrow represents one reaction step,and the dashed arrow indicates several reaction steps. Abbreviations: HMG-CoA: 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A;MVA:mevalonate;IPP,isopentenyl pyrophosphate; DMAPP: dimethylallyl diphosphate;FPP:(E,E)-farnesyl diphosphate;FOH:(E,E)-farnesol; GGPP: (E,E,E)-geranylgeranyl diphosphate; GGOH: (E,E,E)-geranylgeraniol; LPP:labdenedioldiphosphate;PDP:prenyldiphosphate;HMG-R:HMG-CoA reductase(HMG1 encoded);FPS:FPP synthase(ERG20 encoded);GGPPS:GGPP synthase(BTS1 encoded);SsLPPS:LPP synthase of S.sclarea(LPPS encoded);SsTPS:terpene synthase of S.sclarea(TPS encoded).Heterologous genes(LPPS and TPS)were derived from S.sclarea and other genes were cloned from S.cerevisiae.

密度發(fā)酵技術(shù)，香紫蘇醇產(chǎn)量達(dá)到約1.5 g/L[16]。本實(shí)驗(yàn)室最近采用模塊化的途徑工程策略，快速有效地在S.cerevisiae中組裝預(yù)先設(shè)計(jì)好的人工生物合成途徑[7]。本文擬利用香紫蘇醇合成關(guān)鍵酶的生物學(xué)信息，采用模塊途徑工程策略，構(gòu)建香紫蘇醇人工生物合成途徑，探討過表達(dá)代謝關(guān)鍵酶、蛋白質(zhì)融合及異源蛋白信號(hào)肽等因素對(duì)S.cerevisiae工程菌合成香紫蘇醇的影響，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)萜類化合物高產(chǎn)菌株提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所用菌株列于表1。香紫蘇醇、GOH、FOH和GGOH購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自大連寶生物公司。引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司合成。全基因合成及測(cè)序由大連寶生物公司完成。DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑購自當(dāng)?shù)毓?yīng)商。

表1 本文所用菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

S.cerevisiae在30℃、200 r/min下培養(yǎng)。營養(yǎng)缺陷型菌株篩選采用SD培養(yǎng)基 (2%葡萄糖，0.67%含(NH4)2SO4的酵母氮源，不添加氨基酸)。搖瓶培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基 (2%葡萄糖，2%蛋白胨和1%酵母浸膏)。

E.coli在37℃、200 r/min下培養(yǎng)。重組菌株篩選采用LB培養(yǎng)基 (1%NaCl，1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸膏，100μg/mL氨芐青霉素添)。

所有培養(yǎng)基均經(jīng)120℃、20 min滅菌處理。

1.2.2 S.cerevisiae對(duì)香紫蘇醇的耐受性分析

將S.cerevisiae菌株分別在添加了0 mg/L、30.9 mg/L、308.5 mg/L和925.5 mg/L香紫蘇醇的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度分析其生長情況。

1.2.3 全基因合成

SsLPPS和SsTPS基因序列經(jīng)過密碼子優(yōu)化網(wǎng)站 (http://www.jcat.de/Start.jsp)優(yōu)化，使密碼子更適合在S.cerevisiae中表達(dá)。優(yōu)化后的序列由大連寶生物公司合成，分別克隆到pMD19-T載體上，得到重組質(zhì)粒pMD19-T-LPPS和pMD19-T-TPS。全合成的基因用測(cè)序引物pMD18-F(5′-GCCTCTTCGCTATTACGCCA-3′)和pMD18-R(5′-CACTCATTAGGCACCCCAG G-3′)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建

本文所用質(zhì)粒列于表1。重組質(zhì)粒構(gòu)建均采用模塊途徑工程策略的方法[7]。具體步驟為：第一步，用高保真聚合酶進(jìn)行PCR(反應(yīng)條件：95℃5 min；98℃ 10 s，68℃ 4 min，35個(gè)循環(huán)；68℃10 min)克隆各模塊的不同DNA片段，包括啟動(dòng)子、功能基因、終止子和用于重組的重疊序列；第二步，通過高效的多片段融合PCR(共兩輪：前一輪反應(yīng)條件：95℃5 min；98℃10 s，68℃6 min，15個(gè)循環(huán)；72℃10 min；后一輪反應(yīng)條件：95℃5 min；98℃10 s，68℃6 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min)方法在體外將模塊的不同片段融合連接[17]；第三步，利用S.cerevisiae高效地重組性能，將不同模塊的DNA片段及線性化的表達(dá)載體pYX212(EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切)轉(zhuǎn)化到胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，并在相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型平板上篩選。從表型正確的克隆中提取重組質(zhì)粒，進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證各模塊間拼接的準(zhǔn)確性。

1.2.5 香紫蘇醇的提取與檢測(cè)

將測(cè)序正確的載體分別轉(zhuǎn)化S.cerevisiaeBY4741ML，得到工程菌株 S1-S6(圖2)。

將S.cerevisiae工程菌株發(fā)酵醪液與等體積正己烷混和，在30℃下處理30 min。室溫下在玻璃瓶離心 (1 800 r/min)處理8 min，取上層有機(jī)相，濃縮后重懸于正己烷中，待測(cè)。

香紫蘇醇含量利用氣相色譜 (GC7890F)系統(tǒng)分析。采用SE-54型毛細(xì)管色譜柱 (0.25 mm×30 m)，分析條件為：柱溫250℃，進(jìn)樣口溫度270℃，檢測(cè)器溫度290℃，載氣流速1.6 mL/min。在此分析條件下，香紫蘇醇的保留時(shí)間為8.3 min。

2 結(jié)果

2.1 S.cerevisiae的香紫蘇醇耐受性

文獻(xiàn)報(bào)道，香紫蘇醇具有植物病原真菌灰葡萄孢菌Botrytis cinerea的抗菌活性[18]。為驗(yàn)證香紫蘇醇對(duì)真菌釀酒酵母的抗菌活性，考察S.cerevisiaeBY4741ML對(duì)香紫蘇醇的耐受性。與對(duì)照相比，S.cerevisiae在外加925.5 mg/L香紫蘇醇的培養(yǎng)基中生長受到抑制，但抑制率僅為14.3%?？梢?，菌株耐受性應(yīng)不會(huì)成為香紫蘇醇異源合成途徑功能體現(xiàn)的制約因素。

2.2 PDP通路的影響

增加前體供給是一種常用且有效的促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的策略。以往實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)PDP通路的關(guān)鍵酶法尼基焦磷酸 (FPP)合酶(FPPS，ERG20編碼)或 GGPP合酶 (GGPPS，BTS1編碼)(圖1)，或同時(shí)過表達(dá)上述兩個(gè)酶，均有利于工程菌株產(chǎn)生二萜化合物次丹參酮二烯[7]。菌株S2，過表達(dá)FPPS和 GGPPS融合蛋白 (兩蛋白之間用柔性連接肽GGGS連接)及過表達(dá)異源的SsLPPS和SsTPS蛋白，而對(duì)照株菌株S1僅過表達(dá)SsLPPS和SsTPS(圖 2)。實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到菌株S1合成香紫蘇醇 (GC檢測(cè)限約0.1 mg/L)，而菌株S2香紫蘇醇產(chǎn)量達(dá)到(2.05±0.46)mg/L。

圖2 不同釀酒酵母菌株的重組質(zhì)粒 (A)和香紫蘇醇產(chǎn)量 (B)Fig.2 Recombinant plasmids(A)and sclareol production(B)of different S.cerevisiae strains.(A)Genes(arrows with white gene name):BTS1:encoding for GGPP synthase;ERG20:encoding for FPP synthase;LPPS:encoding for LPP synthase;TPS:encoding for terpene synthase;tLPPS:encoding for truncated LPP synthase;and tTPS:encoding for truncated terpene synthase;tHMG1:encoding for HMG-CoA reductase;promoters(green arrows):TPIp,TEF1p and TDH3p;terminators(red rectangles):FBA1t,TDH2t,pYX212t and TDH3t;linker peptide(yellow rectangles):glycine-glycine-glycine-serine(GGGS).Heterologous genes(LPPS,TPS,tLPPS and tTPS)were derived from S.sclarea;other genes,promoters and terminators were cloned from S.cerevisiae.(B)S.cerevisiae cells at 30℃,200 r/min for 48 h,and the culture broth was used for extraction of sclareol.Each result represents the average of three independent clones.

2.3 異源蛋白信號(hào)肽對(duì)香紫蘇醇合成的影響

通過網(wǎng)站TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和ChloroP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)對(duì)SsLPPS和SsTPS進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，并結(jié)合過去的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15]，推測(cè)N-末端分別含有63個(gè)氨基酸和50個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。菌株S3，過表達(dá)去除信號(hào)肽的SsLPPS(tSsLPPS)和SsTPS(tSsTPS)及融合蛋白GGPPS-FPPS(圖2)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株S3香紫蘇醇產(chǎn)量達(dá)到 (5.00±0.66)mg/L，是攜帶信號(hào)肽表達(dá)菌株S2產(chǎn)量的2.4倍?？梢姡コ愒疵傅男盘?hào)肽，有利于其在S.cerevisiae中發(fā)揮功能。

2.4 異源酶融合

將代謝途徑中催化相鄰的兩個(gè)或兩個(gè)以上反應(yīng)的酶融合表達(dá)，可增加代謝途徑通量[7,19]。進(jìn)一步融合異源酶或去除信號(hào)肽的截短異源酶，以確定其對(duì)香紫蘇醇合成的影響。菌株S4和S5在過表達(dá)融合蛋白GGPPS-FPPS的基礎(chǔ)上，分別過表達(dá)融合蛋白LPPS-TPS和tLPPS-tTPS(圖2)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株S4香紫蘇醇產(chǎn)量達(dá)到(6.05±0.59)mg/L，是菌株S3的1.21倍。然而，菌株S5僅獲得 (0.81±0.15)mg/L香紫蘇醇，明顯低于菌株S3。

2.5 MVA途徑對(duì)香紫蘇醇合成的影響

羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 (HMGR，HMG1編碼)是MVA途徑的限速酶。相對(duì)于完整的 HMGR，去除了 N-端 529 aa調(diào)控序列的HMGR(tHMGR，tHMG1編碼)更有利于促進(jìn)人工生物合成途徑的活性[7,20]。因此，在菌株S4的基礎(chǔ)上進(jìn)一步過表達(dá)tHMGR，得到菌株S6(圖2)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株S6香紫蘇醇產(chǎn)量達(dá)到(8.96±0.96)mg/L，是菌株S4的1.48倍，是當(dāng)前香紫蘇醇產(chǎn)量較高的S.cerevisiae工程菌。

3 討論

本文以S.cerevisiaeBY4741ML為宿主，構(gòu)建香紫蘇醇的人工生物合成途徑。共構(gòu)建了6株重組菌株S1至S6，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵后，對(duì)其香紫蘇醇的產(chǎn)量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示?？梢姡瑑H引入異源的香紫蘇醇合成兩個(gè)關(guān)鍵酶LPPS和TPS的菌株S1，未見香紫蘇醇產(chǎn)生 (檢測(cè)限0.1 mg/L)；然而，增加二萜化合物前體合成的PDP通路中相應(yīng)關(guān)鍵酶，即FPPS和GGPPS，使菌株S2的香紫蘇醇產(chǎn)量達(dá)到 (2.05±0.46)mg/L，說明前體代謝流的加強(qiáng)，可為人工生物合成途徑提供更多前體，并且過表達(dá)融合蛋白GGPPS-FPPS更有利于代謝流流向GGPP。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，菌株S1中可檢測(cè)到 (0.08±0.02)mg/L的FPP水解副產(chǎn)物FOH，而菌株S2則未檢測(cè)到FOH。通過去除異源酶的N-端信號(hào)肽，即過表達(dá)tLPPS和tTPS，菌株S3的產(chǎn)量相對(duì)菌株S2提高144%，可能因?yàn)樾盘?hào)肽去除后更有利于蛋白表達(dá)，或它們?cè)赟.cerevisiae中的活性更高。菌株S4和S5分別表達(dá)融合的全長和融合的去除N-端信號(hào)肽的異源酶，即分別為LPPS-TPS和tLPPS-tTPS，經(jīng)過香紫蘇醇的產(chǎn)量比較，相對(duì)菌株S3，菌株S4的產(chǎn)量提高21%，而菌株S5反而降低84%。其中，菌株S4產(chǎn)量提高可能是由于蛋白質(zhì)融合拉近了反應(yīng)活性中心的距離，使前一步反應(yīng)的產(chǎn)物易于到達(dá)下一步反應(yīng)的活性中心，從而減少底物擴(kuò)散。文獻(xiàn)報(bào)道，將雙酶催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為一個(gè)雙功能蛋白催化后，產(chǎn)量可增加30%以上[21]。奇怪的是，菌株S5卻沒有取得很好的結(jié)果，推測(cè)可能由于截短N(yùn)端序列的兩蛋白融合后，導(dǎo)致C-端蛋白 (TPS)的空間構(gòu)型發(fā)生變化，降低了催化活性。為進(jìn)一步提高產(chǎn)量，構(gòu)建了菌株S6，即在前面較高產(chǎn)量的菌株S4中進(jìn)一步過表達(dá)MVA途徑的關(guān)鍵酶HMGR的催化部分(tHMGR)，相對(duì)菌株S4，香紫蘇醇的產(chǎn)量提高48%。文獻(xiàn)構(gòu)建了香紫蘇醇大腸桿菌工程菌株，結(jié)合高密度發(fā)酵技術(shù)，產(chǎn)量已達(dá)到約1.5 g/L[16]。因此，尚需要進(jìn)一步改造相關(guān)途徑或采用發(fā)酵工程技術(shù)，以提高S.cerevisiae工程菌株香紫蘇醇產(chǎn)量。

[1]Bohlmann J,Keeling CI.Terpenoid biomaterials.Plant J,2008,54(4):656?669.

[2]Misawa N.Pathway engineering for functional isoprenoids.Curr Opin Biotechnol,2011,22(5):627?633.

[3]Ajikumar PK,Tyo K,Carlsen S,et al.Terpenoids:opportunities for biosynthesis of natural product drugs using engineered microorganisms. Mol Pharm,2008,5(2):167?190.

[4]Martin VJ,Pitera DJ,Withers ST,et al.Engineering a mevalonate pathway inEscherichia colifor production of terpenoids.Nat Biotechnol,2003,21(7):796?802.

[5]Ajikumar PK,Xiao WH,Tyo KE,et al.Isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction inEscherichia coli.Science,2010,330(6000):70?74.

[6]Alper H, Miyaoku K, Stephanopoulos G.Construction of lycopene-overproducingE.colistrains by combining systematic and combinatorial gene knockout targets.Nat Biotechnol,2005,23(5):612?616.

[7]Zhou YJ,Gao W,Rong Q,et al.Modular pathway engineering ofditerpenoid synthases and the mevalonic acid pathway for miltiradiene production.JAm Chem Soc,2012,134(6):3234?3241.

[8]Tokuhiro K,Muramatsu M,Ohto C,etal.Overproduction of geranylgeraniol by metabolically engineeredSaccharomycescerevisiae. Appl Environ Microbiol,2009,75(17):5536?5543.

[9]Ohto C, Muramatsu M, Obata S, et al.Overexpression of the gene encoding HMG-CoA reductase inSaccharomycescerevisiaefor production of prenyl alcohols.Appl Microbiol Biotechnol,2009,82(5):837?845.

[10]Dai Z,Liu Y,Huang L,et al.Production of miltiradiene by metabolically engineeredSaccharomycescerevisiae. Biotechnol Bioeng,2012,109(11):2845?2853.

[11]Farhi M,Marhevka E,Masci T,et al.Harnessing yeast subcellular compartments for the production of plantterpenoids.Metab Eng,2011,13(5):474?481.

[12]Dimas K,Kokkinopoulos D,Demetzos C,et al.The effectofsclareolon growth and cellcycle progression of human leukemic cell lines.Leuk Res,1999,23(3):217?234.

[13]Dimas K,Hatziantoniou S,Tseleni S,et al.Sclareol induces apoptosis in human HCT116 colon cancer cellsin vitroand suppression of HCT116 tumor growth in immunodeficient mice.Apoptosis,2007,12(4):685?694.

[14]Mahaira LG,Tsimplouli C,Sakellaridis N,et al.The labdanediterpene sclareol(labd-14-ene-8,13-diol)induces apoptosis in human tumor cell lines and suppression of tumor growthin vivovia a p53-independentmechanism ofaction.Eur J Pharmacol,2011,666(1/3):173?182.

[15]Schalk M.Method for producing sclareol.WO,2009101126.2009-08-20.

[16]Schalk M,Pastore L,Mirata MA,et al.Toward a biosynthetic route to sclareol and amber odorants.J Am Chem Soc,2012,134(46):18900?18903.

[17]Yu JH,Hamari Z,Han KH,et al.Double-joint PCR:a PCR-based moleculartoolforgene manipulations in filamentous fungi.Fungal Genet Biol,2004,41(11):973?981.

[18]Stukkens Y,Bultreys A,Grec S,et al.NpPDR1,a pleiotropic drug resistance-type ATP-binding cassette transporter fromNicotiana plumbaginifolia,plays a major role in plant pathogen defense.Plant Physiol,2005,139(1):341?352.

[19]Dueber JE,Wu GC,Malmirchegini GR,et al.Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux.Nat Biotechnol,2009,27(8):753?759.

[20]Donald KA,Hampton RY,Fritz IB.Effects of overproduction of the catalytic domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase on squalene synthesis inSaccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol,1997,63(9):3341?3344.

[21]Varman AM, Xiao Y, Leonard E, et al.Statistics-based model for prediction of chemical biosynthesis yield fromSaccharomyces cerevisiae.Microb Cell Fact,2011,10:45.