汪建峰，蒙海林，熊智強(qiáng)，王勇

1中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

2華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

天然產(chǎn)物一直都是臨床藥物開發(fā)的重要源泉。近十年來(lái)基因組、宏基因組測(cè)序工作的大規(guī)模開展以及新的高效篩選方法的引入，讓人們重新認(rèn)識(shí)到自然界中存在著遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出預(yù)期的天然產(chǎn)物或與其合成相關(guān)的基因資源，合成生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)更是讓天然產(chǎn)物的研究獲得了全新的機(jī)遇[1-2]。合成生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)深深地影響了天然產(chǎn)物研究的各個(gè)環(huán)節(jié)，天然產(chǎn)物從初期的篩選，到后續(xù)的開發(fā)、生產(chǎn)和制造正在發(fā)生一場(chǎng)深刻的變革。通過(guò)挖掘天然產(chǎn)物合成相關(guān)的生物學(xué)元件，經(jīng)理性設(shè)計(jì)并在底盤細(xì)胞中集成裝配，進(jìn)一步結(jié)合人工生物系統(tǒng)中各功能模塊的優(yōu)化與適配后，可有效地進(jìn)行珍稀天然產(chǎn)物高效合成[3]。植物源抗瘧疾藥物青蒿素的中間體青蒿酸的微生物合成即是這一領(lǐng)域最成功的典范。Keasling及其合作者經(jīng)過(guò)十多年的努力，陸續(xù)完成了青蒿酸合成途徑基因的分離，在釀酒酵母細(xì)胞中對(duì)青蒿酸合成途徑進(jìn)行重新設(shè)計(jì)、集成裝配、模塊適配等工作，最終使釀酒酵母合成了超過(guò)25 g/L的青蒿酸[4]。該工作成功地利用微生物發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)植物來(lái)源的青蒿酸，實(shí)現(xiàn)全天候廉價(jià)地生產(chǎn)珍稀天然藥物。傳統(tǒng)天然產(chǎn)物及生物學(xué)的研究已經(jīng)為天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究提供了大量的生物學(xué)素材，但隨著研究的深入，亟需開發(fā)更多的生物元件，并對(duì)現(xiàn)有的生物元件庫(kù)進(jìn)行更新升級(jí)和標(biāo)準(zhǔn)化，為構(gòu)建相關(guān)的細(xì)胞工廠實(shí)現(xiàn)珍稀化合物的大量合成或獲得更多的新穎化合物打下基礎(chǔ)。此外，隨著人工合成系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜度的增加，也需要進(jìn)一步發(fā)展新的理論和方法，更科學(xué)地進(jìn)行生物元件到功能模塊與系統(tǒng)的組裝適配[5]。本文將以天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究為背景，從生物元件的人工設(shè)計(jì)，生物元件的挖掘，由生物元件到功能模塊系統(tǒng)的組裝適配來(lái)闡述該領(lǐng)域的研究思路與方法。

1 合成生物學(xué)元件的人工理性設(shè)計(jì)

生物元件 (Biological parts)是具有特定功能的氨基酸或核苷酸序列，如用于基因表達(dá)調(diào)控的調(diào)控元件 (包括啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn) (RBS))，特定功能的結(jié)構(gòu)元件 (如天然產(chǎn)物合成途徑中酶基因)等。它們是生物體最基本的組成單元，也是合成生物學(xué)研究中構(gòu)建人工生命體最基礎(chǔ)的磚塊[6]。不同來(lái)源不同功能的生物元件，可以通過(guò)復(fù)雜的設(shè)計(jì)，與其他元件或模塊組裝成更大規(guī)模的具有特定生物學(xué)功能的生物回路、裝置和系統(tǒng)。因此，生物元件的挖掘與開發(fā)是設(shè)計(jì)與組裝更高層次的功能模塊和生命系統(tǒng)的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究積累大量的DNA和蛋白質(zhì)元件，并對(duì)許多元件進(jìn)行了定義?？蒲腥藛T將這些生物元件整理歸檔到了一系列開放的元件庫(kù)中，如美國(guó)麻省理工大學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)生物元件登記庫(kù) (Registry of Standard Biological Parts，http://partsregistry.org)，Keasling教授課題組開發(fā)的The Joint BioEnergy Institute Inventory of Composable Elements(JBEI-ICEs)[7]等。這些元件庫(kù)的建立大大促進(jìn)了元件的標(biāo)準(zhǔn)化，方便了其在合成生物學(xué)方面的應(yīng)用。但是相對(duì)于浩瀚的天然生物資源，已開發(fā)的資源還是極其有限的，僅以微生物資源為例，可培養(yǎng)的微生物僅僅占微生物資源總量的1%，這些未開發(fā)的生物資源中蘊(yùn)藏著大量功能新穎的生物元件[8]。此外更精細(xì)復(fù)雜的合成生物學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，對(duì)生物元件的功能及生物特性等提出了更高品質(zhì)的要求。因此設(shè)計(jì)與開發(fā)更高品質(zhì)的非天然元件，挖掘更多特性新穎的天然元件，是豐富生物元件庫(kù)的兩大策略，也是合成生物學(xué)發(fā)展最原始的驅(qū)動(dòng)力。根據(jù)設(shè)計(jì)策略的差別主要有兩種方法：一是基于隨機(jī)突變與文庫(kù)篩選的方法，二是基于模型計(jì)算和預(yù)測(cè)的理性設(shè)計(jì)方法。

雖然通過(guò)構(gòu)建文庫(kù)的方法來(lái)設(shè)計(jì)符合預(yù)期特性的啟動(dòng)子或RBS等調(diào)控元件是一種非常有效的方法，但大規(guī)模人工生命系統(tǒng)的構(gòu)建往往涉及數(shù)目龐大的調(diào)控元件，而文庫(kù)的構(gòu)建與元件的篩選效率低下。此外許多蛋白質(zhì)元件 (如酶蛋白，調(diào)控蛋白等)缺少高通量模型，無(wú)法快速地進(jìn)行文庫(kù)篩選以獲得預(yù)期功能的突變體。因此根據(jù)掌握的元件序列與功能之間存在的特殊關(guān)系，建立計(jì)算機(jī)模型對(duì)元件的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行改造，理性設(shè)計(jì)具有預(yù)期功能和控制特性的元件是元件設(shè)計(jì)的重要方向。

De May等[9]利用偏最小二乘 (PLS)回歸法建立了大腸桿菌組成型啟動(dòng)子序列與強(qiáng)度關(guān)系的預(yù)測(cè)模型，但預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度有待提高。在模型預(yù)測(cè)的指導(dǎo)下可合理地選擇最適強(qiáng)度的啟動(dòng)子并結(jié)合啟動(dòng)子敲入 (Knock-in)技術(shù)去調(diào)控代謝途徑上基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)途徑的優(yōu)化[10]。Rhodius等[11]以大腸桿菌中σE因子識(shí)別和結(jié)合的啟動(dòng)子為代表，提出了一種基于位置權(quán)重矩陣(PWM)模型的強(qiáng)度預(yù)測(cè)方法。他們把60個(gè)σE啟動(dòng)子的?35～+20區(qū)域劃分為?35、?10、spacer等功能模體，并對(duì)每個(gè)功能模體進(jìn)行PWM打分，然后對(duì)PWM得分總和與強(qiáng)度值的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性化擬合，發(fā)現(xiàn)部分模體的聯(lián)合得分與啟動(dòng)子強(qiáng)度具有較好的相關(guān)性，R值普遍在0.57至0.77之間。而在RBS設(shè)計(jì)方面，Salis等[12]通過(guò)將描述翻譯起始的生物物理模型與最優(yōu)化算法相結(jié)合，提出了一套熱力學(xué)預(yù)測(cè)模型用于RBS的設(shè)計(jì)。它通過(guò)預(yù)測(cè)RBS與核糖體結(jié)合的強(qiáng)度，可對(duì)蛋白翻譯的起始速率及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量調(diào)控。該模型的擬合相關(guān)系數(shù)較高 (|R|最高達(dá)到0.9)。

以上的研究雖然在啟動(dòng)子或RBS強(qiáng)度預(yù)測(cè)方面已取得了一些進(jìn)展，但完全基于強(qiáng)度預(yù)測(cè)的理性設(shè)計(jì)仍然是十分困難的，主要是由于已有模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度偏低，難以從真正意義上實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子或RBS的序列設(shè)計(jì)，而且缺乏通用性。實(shí)際上，由于序列與強(qiáng)度之間存在十分復(fù)雜的非線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，而現(xiàn)有模型普遍采用線性回歸分析方法或經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單數(shù)據(jù)處理 (比如取對(duì)數(shù))后的回歸分析方法難以反映這些復(fù)雜的內(nèi)在關(guān)系，從而導(dǎo)致預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率偏低。為解決這一難題，本實(shí)驗(yàn)室采用了非線性映射能力很強(qiáng)的建模方法——人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (Artificial neural network，ANN)來(lái)反映這些非線性關(guān)系[13]，如圖1所示，建立了預(yù)測(cè)效果更佳、普適性更好的預(yù)測(cè)模型和方法，這些模型和方法可用于指導(dǎo)合成生物學(xué)精細(xì)調(diào)控元件的理性設(shè)計(jì)。

以原核Trc啟動(dòng)子&RBS調(diào)控元件為例，首先基于易錯(cuò)PCR技術(shù)及熒光定量篩選法構(gòu)建了其突變文庫(kù) (包含100個(gè)序列，相對(duì)強(qiáng)度值介于0～3.56之間)。將文庫(kù)數(shù)據(jù)隨機(jī)分為訓(xùn)練集 (不超過(guò)90個(gè)數(shù)據(jù))和測(cè)試集 (不少于10個(gè)數(shù)據(jù))兩個(gè)集合，用Matlab建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，并用訓(xùn)練集數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練。模型對(duì)測(cè)試集數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)誤差隨著訓(xùn)練集規(guī)模的增加而減小，當(dāng)訓(xùn)練集達(dá)到90個(gè)數(shù)據(jù)時(shí)，模型的總體預(yù)測(cè)性能達(dá)到最佳。在經(jīng)過(guò)神經(jīng)元個(gè)數(shù)、網(wǎng)絡(luò)層數(shù)、訓(xùn)練參數(shù)等多種參數(shù)綜合優(yōu)化之后，在已構(gòu)建的1 326 000個(gè)模型中，獲得了5個(gè)預(yù)測(cè)性能非常好的模型，這些模型解決了BP網(wǎng)絡(luò)在訓(xùn)練中容易出現(xiàn)的過(guò)擬合問(wèn)題，使模型對(duì)測(cè)試集數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)結(jié)果非常接近于實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果。圖1給出了最優(yōu)模型(NET90_19_576)的訓(xùn)練和預(yù)測(cè) (測(cè)試)結(jié)果，其訓(xùn)練和預(yù)測(cè)的擬合相關(guān)系數(shù) (R值)都達(dá)到了0.98，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)PWM等方法 (圖1B)，表明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型很好地反映了元件序列和強(qiáng)度之間復(fù)雜的非線性關(guān)系。

圖1 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)理性設(shè)計(jì)Trc啟動(dòng)子&RBS調(diào)控元件[13](A：調(diào)控元件構(gòu)建的流程圖。B：對(duì)Trc啟動(dòng)子&RBS元件進(jìn)行PWM打分后的最佳擬合結(jié)果。C：采用ANN方法進(jìn)行對(duì)訓(xùn)練集數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)結(jié)果與測(cè)量結(jié)果之間的擬合。D：采用ANN方法進(jìn)行對(duì)測(cè)試集數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)結(jié)果與測(cè)量結(jié)果之間的擬合。E：人工設(shè)計(jì)元件的預(yù)期值與實(shí)驗(yàn)測(cè)量值)Fig.1 Rational design of Trc promoter&RBS regulatory element using artificial neural network[13].(A)The workflow of regulatory element library construction.(B)The best fitting results of log Trc promoter&RBS activities with their PWM scores.(C)The predicted relative strengths of promoter&RBS fit with the measured values using the data of training set.(D)The predicted values fit with the measured values using the data of test set.(E)The desired and measured strength of artificially designed elements.

以模型NET90_19_576為基礎(chǔ)，進(jìn)一步對(duì)野生型序列的每個(gè)堿基進(jìn)行單位點(diǎn)突變，由模型預(yù)測(cè)相應(yīng)的強(qiáng)度值，考察每個(gè)位點(diǎn)對(duì)強(qiáng)度值的影響，從而得到“關(guān)鍵位點(diǎn)”及“非關(guān)鍵位點(diǎn)”。隨后基于“關(guān)鍵位點(diǎn)”的組合突變?cè)O(shè)計(jì)Matlab程序，用NET90_19_576模型實(shí)現(xiàn)了全新序列的從頭設(shè)計(jì)。用所設(shè)計(jì)的元件序列，成功地實(shí)現(xiàn)了小肽BmK1在大腸桿菌中有效表達(dá)和萜類化合物合成途徑的精細(xì)定量調(diào)控。這不僅有效地解決了小肽蛋白的高效表達(dá)及代謝網(wǎng)絡(luò)的精確調(diào)控等問(wèn)題，也證明了通過(guò)人工理性設(shè)計(jì)的方法所獲得的調(diào)控序列是可行的、可靠的。該結(jié)果表明了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法在精細(xì)調(diào)控元件理性設(shè)計(jì)上的應(yīng)用價(jià)值，以及人工設(shè)計(jì)元件在合成生物學(xué)中的巨大應(yīng)用潛力。

2 天然產(chǎn)物合成相關(guān)元件的挖掘、集成與裝配

某一特定代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的一組基因，在底盤細(xì)胞中重新設(shè)計(jì)、組裝和集成，就能利用底盤細(xì)胞已有的代謝網(wǎng)絡(luò)合成目標(biāo)產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的異源高效合成。根據(jù)合成途徑和構(gòu)建單元的模塊化特性，目前研究人員已經(jīng)在不同的微生物宿主中 (如大腸桿菌Escherichia coli，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，橙黃色粘球菌Myxococcus xanthus)[1,14]成功地構(gòu)建了萜類(單萜，倍半萜，二萜等)[15]，聚酮類 (Erythromycin A，Epothilone D 等)[16]，苯丙烷酸類 (Resveratrol，Narigenin等)[17]，生物堿類化合物[18]的異源合成模塊，如表1所示。挖掘和利用已有的生物元件，理性地設(shè)計(jì)和組裝更高效的異源途徑是途徑重構(gòu)的努力目標(biāo)。

2.1 前體合成模塊的改造

如何重構(gòu)底盤細(xì)胞，尤其是其前體合成模塊，強(qiáng)化前體供應(yīng)是構(gòu)建高效底盤細(xì)胞的一個(gè)重要方面。目前，研究人員重點(diǎn)從前體合成直接相關(guān)的途徑入手，通過(guò)特性元件的替換和表達(dá)強(qiáng)度的精細(xì)調(diào)控，打破途徑存在的代謝瓶頸與負(fù)調(diào)控[19-20]。大量的研究表明引入下游合成模塊以后，宿主內(nèi)源的代謝往往無(wú)法為其提供足夠的前體和輔因子。如大腸桿菌本身不能合成萜類化合物，僅能由2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸 (MEP)途徑合成少量的異戊烯基焦磷酸/二甲基烯丙基焦磷酸 (IPP/DMAPP)前體，用于某些必需的細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的合成。因此當(dāng)萜類合成的下游模塊引入到野生型大腸桿菌以后，往往只能合成非常微量的目的產(chǎn)物[39]。

甲羥戊酸 (MVA)途徑和MEP途徑是天然存在的兩條萜類化合物前體IPP/DMAPP合成途徑。兩個(gè)模塊以不同碳單位 (MVA途徑以乙酰-CoA為單位，MEP途徑以三磷酸甘油醛和丙酮酸為單位)起始，在合成途徑和反應(yīng)上表現(xiàn)出完全不同的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)特性。Keasling等[38]創(chuàng)造性地將酵母MVA途徑模塊完全引入E.coli中，構(gòu)建了同時(shí)擁有MVA途徑和MEP途徑兩前體合成模塊的工程菌株，大大提高了菌株的萜類合成能力。后續(xù)的改造發(fā)現(xiàn)用來(lái)自糞鏈球菌EnterococcusfaecalisMVA途徑模塊的HMG-CoA合成酶基因，HMG-CoA還原酶基因代替酵母模塊相應(yīng)的基因后，可以進(jìn)一步提高異戊烯的合成[40]。這些研究表明不同菌株來(lái)源的元件和模塊是工程菌株前體合成模塊改造的重要資源，通過(guò)這些元件和模塊的裝配能夠顯著增強(qiáng)底盤細(xì)胞前體的供應(yīng)。雖然外源MVA途徑和內(nèi)源MEP途徑模塊同時(shí)存在的方式，能夠顯著提高萜類的合成能力，但是我們通過(guò)全基因組模型的分析，發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中MEP途徑比MVA途徑具有更大的代謝潛力[41]。隨著許多以MEP途徑為萜類前體供應(yīng)途徑并含有豐富萜類次級(jí)代謝的微生物的陸續(xù)報(bào)道，MEP途徑元件和模塊的數(shù)據(jù)也越來(lái)越多，而且不同來(lái)源的元件表現(xiàn)出完全不同的催化和調(diào)控特性。本研究組選取了鏈霉菌、芽胞桿菌、糖多胞菌、歐文氏菌等不同菌屬為代表，系統(tǒng)地挖掘了相關(guān)的dxs、ispD、ispF、idi等MEP途徑基因元件 (圖2)。結(jié)果表明阿維鏈霉菌來(lái)源的dxs2基因，大腸桿菌來(lái)源的ispF基因，紅霉糖多胞菌來(lái)源的ispD基因，枯草芽胞桿菌和阿維來(lái)源的idi基因能夠明顯地強(qiáng)化大腸桿菌MEP途徑的代謝通量，增加萜類化合物Amorphadiene和Lycopene的合成。隨后我們以過(guò)表達(dá)阿維鏈霉菌dxs2基因的工程菌作為出發(fā)菌株，通過(guò)逐次疊加共表達(dá)大腸桿菌ispF基因，紅霉糖多胞菌ispD基因，枯草芽胞桿菌idi基因，阿維鏈霉菌idi基因，獲得了共表達(dá)阿維鏈霉菌dxs2和枯草芽胞桿菌idi基因的工程菌，分別使Amorphadiene和Lycopene的產(chǎn)量相對(duì)于原始菌株增加了15.5倍和16.5倍。對(duì)MEP途徑的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)阿維鏈霉菌dxs2和枯草芽胞桿菌idi基因菌株的內(nèi)源MEP途徑基因的轉(zhuǎn)入水平獲得了明顯地強(qiáng)化。這些研究結(jié)果表明表達(dá)某些來(lái)源的MEP途徑基因不僅能夠強(qiáng)化途徑中關(guān)鍵步驟的活性，同時(shí)也能夠激活大腸桿菌內(nèi)源MEP途徑基因的表達(dá)，從而有效地解除MEP途徑的代謝瓶頸。

表1 重要天然產(chǎn)物的異源合成Table 1 Heterologous biosynthesis of important natural products

2.2 下游合成模塊的設(shè)計(jì)與裝配

隨著基因組學(xué)研究的深入，越來(lái)越多的化合物生物合成途徑及其相關(guān)基因被陸續(xù)闡明。從這些研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)某一個(gè)特定化合物的合成途徑往往存在于來(lái)自不同種屬的生物體中，如胡蘿卜素類化合物的合成途徑廣泛分布于植物、細(xì)菌、真菌中[42]。同一化合物不同種屬來(lái)源的途徑也表現(xiàn)出明顯的差異性，如Lycopene合成途徑的八氫番茄紅素脫氫酶[43]。此外，同一家族的許多化合物具有相似的母核，共有部分代謝途徑。所有這些大自然賦予的生物合成途徑多樣性和相似性都可以被用于某個(gè)化合物異源合成模塊的設(shè)計(jì)和裝配。據(jù)報(bào)道甜葉菊Steviarebaudiana中的甜菊糖和二萜化合物赤霉素的合成途徑均以貝殼烯酸作為共有中間代謝物，因此產(chǎn)赤霉素的植物和微生物中與貝殼烯酸合成相關(guān)的基因是甜菊糖異源合成途徑構(gòu)建的重要資源[44-45]。本研究組系統(tǒng)地挖掘了數(shù)據(jù)庫(kù)中與貝殼烯及終產(chǎn)物甜菊糖類化合物合成相關(guān)的基因資源，在E.coli中重構(gòu)了異源合成途徑，實(shí)現(xiàn)了由微生物從頭合成萊鮑迪苷A(圖2)。與所有萜類化合物一樣，甜葉菊中萊鮑迪苷A的合成是以IPP和DMAPP為前體，經(jīng)GGPPS，古巴焦磷酸合酶 (CDPS)，貝殼烯合酶 (KS)催化后形成貝殼烯，再經(jīng)兩個(gè)P450氧化酶貝殼烯氧化酶 (KO)和貝殼烯酸羥化酶 (KAH)作用形成二萜母核甜菊醇。甜菊醇經(jīng)四步糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)(UGT85C2，？，UGT74G1，UGT76G1)，最終合成萊鮑迪苷A。我們還以更具活性的加拿大紅豆杉GGPPS取代甜葉菊的GGPPS，利用小立碗蘚Physcomitrella patens的雙功能KS[46]取代甜葉菊的CDPS和KS重構(gòu)貝殼烯合成途徑，使貝殼烯的產(chǎn)量獲得了明顯提高。由于甜菊糖的合成途徑中，存在著一步未知的糖基轉(zhuǎn)移酶，因此基于甜葉菊來(lái)源的元件目前還無(wú)法構(gòu)建完成的瑞鮑迪苷A合成途徑。本課題組利用最大的碳水化合物活性酶 (Carbohydrate-ActiveenZymes，CAZymes)數(shù)據(jù)庫(kù)，從1 000多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶中篩選出了真菌斯塔摩酵母Candida bombicola的UGTB1糖基轉(zhuǎn)移酶，可能具有催化甜菊糖合成第二步糖基轉(zhuǎn)移的活性[47]。于是將UGTB1與甜葉菊的KO/P450氧化還原蛋白 (CPR)，甜葉菊KAH、UGT85C2糖基轉(zhuǎn)移酶、UGT74G1糖基轉(zhuǎn)移酶、UGT76G1糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步組裝到了甜葉菊合成途徑中，最終實(shí)現(xiàn)了瑞鮑迪苷A的從頭合成。

圖2 萜類化合物高產(chǎn)菌株的構(gòu)建.Fig.2 Construction of high-yield isoprenoids producers.

在重構(gòu)紫杉醇途徑的過(guò)程中，受到植物來(lái)源的元件有限，而且往往受到物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的影響，在微生物宿主中表達(dá)與活性均不甚理想，需要經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化及催化特性的改造?？紤]到產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌資源的多樣性，本課組以Ta x o l生物合成基因簇中紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase，TS)、C-13苯丙氨酸側(cè)鏈輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶 (C-13 phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase，BAPT)和 10巴卡亭III酰基轉(zhuǎn)移酶 (10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase，DBAT)為靶向設(shè)計(jì)了同源引物，通過(guò)對(duì)紅豆杉來(lái)源的內(nèi)生真菌樣品進(jìn)行保守序列PCR，從產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌中篩選出了新的TS、BAPT和DBAT功能元件[48]。經(jīng)簡(jiǎn)單的序列分析發(fā)現(xiàn)這些真菌來(lái)源的元件與植物來(lái)源的相比，具有很低的同源性，可以為異源Taxol合成途徑的組裝提供更多元化選擇。

2.3 產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的裝配

圖3 產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)模塊的改造.Fig.3 Modification of the product transportation module.

在底盤細(xì)胞中通過(guò)重構(gòu)合成途徑，進(jìn)行天然產(chǎn)物的異源合成，如何解決異源產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加底盤細(xì)胞對(duì)產(chǎn)物的耐受性是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，這也是提高工程菌株產(chǎn)物合成能力的重要手段。許多產(chǎn)生復(fù)雜次生代謝物的宿主具有多種天然的機(jī)制以確保產(chǎn)物可以運(yùn)出胞外，并使訴諸本身對(duì)特定產(chǎn)物具有一定的耐受性，如廣泛存在的多藥耐藥泵系統(tǒng)、熱激蛋白的表達(dá)、細(xì)胞膜的修飾等機(jī)制。多藥外排泵系統(tǒng) (Multidrug Efflux Pump)是一類廣泛存在的能夠?qū)麅?nèi)的藥物或毒性物質(zhì)排除胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，如大腸桿菌的三組分耐藥泵AcrAB-TolC系統(tǒng)，綠膿假單胞菌Pseudomonas aeruginosa中的MexAB-OprM系統(tǒng)等具有非常寬泛的底物特異性，可以將多種抗生素、有機(jī)溶劑、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外[49]。在萜類化合物的異源合成研究中，本課題組以大腸桿菌的三組分耐藥泵作為改造對(duì)象 (圖3)，通過(guò)逐個(gè)強(qiáng)化大腸桿菌內(nèi)源AcrAB-TolC各組分的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外膜通道蛋白TolC及外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB的過(guò)表達(dá)能夠顯著提高萜類化合物Amorphadiene和貝殼烯的合成[50]?？紤]到三組分耐藥泵是一個(gè)以AcrA：AcrB：TolC=3:6:3精細(xì)裝配的分子機(jī)器，我們對(duì)3個(gè)組分進(jìn)行兩兩組合強(qiáng)化表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行各組分比例的精細(xì)調(diào)控。最終組合TolC&TolC&AcrB使Amorphadiene的比產(chǎn)率提高了118%，而AcrA&TolC&AcrB使貝殼烯的比產(chǎn)率提高了104%。這些結(jié)果說(shuō)明強(qiáng)化工程菌株的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)確實(shí)能夠有效地提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成。三組分耐藥泵作為最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，針對(duì)其的改造具有非常重要的意義。除大腸桿菌內(nèi)源的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，許多耐藥菌也存在著類似的系統(tǒng)。于是我們?cè)诖竽c桿菌中過(guò)表達(dá)了來(lái)自綠膿假單胞菌的MexAB-OprM轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，當(dāng)單獨(dú)表達(dá)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MexB時(shí)，Amorphadiene和貝殼烯的比產(chǎn)率提高了70%，比單獨(dú)表達(dá)TolC或AcrB取得了更明顯的效果。此外我們也嘗試異源轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組合表達(dá)及異源內(nèi)源組分的共表達(dá)，相比于前述AcrAB-TolC組分的組合表達(dá)，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率沒有能夠取得更進(jìn)一步的提高，但是異源耐藥泵仍舊是轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)重構(gòu)的重要元件。

3 合成生物學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)化與適配

異源合成模塊的導(dǎo)入使原有宿主系統(tǒng)獲得合成某種目標(biāo)產(chǎn)物的能力，但其生產(chǎn)效率及產(chǎn)率通常仍處于較低水平，無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。這是由于異源合成模塊與原有宿主系統(tǒng)之間尚存在不適配問(wèn)題。因此，從整體上對(duì)宿主系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化并改善其與異源合成模塊之間的互作與適配，是大幅提高下游目標(biāo)產(chǎn)物合成效率的重要研究?jī)?nèi)容。

3.1 異源合成系統(tǒng)的優(yōu)化與設(shè)計(jì)

盡管經(jīng)典的誘變育種及代謝工程策略已成功應(yīng)用于優(yōu)化宿主系統(tǒng)和提高產(chǎn)率，但誘變育種具有很大的隨機(jī)性，給定向篩選帶來(lái)很大的困難，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；代謝工程則對(duì)多基因決定的性狀難以達(dá)到理想效果[51]，而且難以發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)產(chǎn)物代謝不直接相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。近年來(lái)，基因組尺度代謝模型 (GSMM)的提出[52]使菌種改造研究提升到系統(tǒng)的高度。基于GSMM，采用通量平衡分析 (FBA)[53]、最小代謝調(diào)整分析 (MOMA)[54]等in silico分析方法，可發(fā)現(xiàn)某些影響目標(biāo)產(chǎn)物合成的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)，尤其是與產(chǎn)物合成不密切相關(guān)的靶點(diǎn)。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的理性分析設(shè)計(jì)，可以有效減少實(shí)驗(yàn)的盲目性，提高工作效率并降低實(shí)驗(yàn)成本。為此，本實(shí)驗(yàn)室在FBA、MOMA等經(jīng)典算法的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)了兩套算法(FDCA和LMOMA-Based)[55]，并用于預(yù)測(cè)一些可能提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的關(guān)鍵基因改造靶點(diǎn)(圖 4)。

圖4 基于FDCA及LMOMA算法的異源合成系統(tǒng)設(shè)計(jì)與優(yōu)化Fig.4 Heterologous biosynthetic system design and optimization based on FDCA and LMOMA algorithm.

我們以大腸桿菌為宿主、葡萄糖為底物、紅霉素中間體6dEB作目標(biāo)產(chǎn)物為例，通過(guò)FDCA和LMOMA-Based算法獲得了一些潛在基因敲除位點(diǎn)[55]，為提高6dEB異源合成產(chǎn)率奠定了理論基礎(chǔ)。

3.2 元件與模塊的適配

基于GSMM的整體代謝優(yōu)化可改善宿主的網(wǎng)絡(luò)流量分布，使代謝流量盡可能多地流向目標(biāo)產(chǎn)物的合成。然而，異源合成模塊與宿主系統(tǒng)之間并非是完美協(xié)作的，各元件之間、下游與前體模塊之間如何實(shí)現(xiàn)合理的搭配，消除元件、模塊之間因不適配而引起中間代謝物積累與能量的消耗，也是增強(qiáng)目的產(chǎn)物合成的重要手段。這是因?yàn)榧?xì)胞生命活動(dòng)是時(shí)間和空間上都是多層次交互作用 (DNA復(fù)制，基因轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)翻譯，物質(zhì)與能量代謝，代謝物的運(yùn)輸與分泌，細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等)的結(jié)果，僅僅基于不同模塊代謝網(wǎng)絡(luò)之間代謝流量的分析，進(jìn)行生物模塊之間的簡(jiǎn)單改造是無(wú)法實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的最佳適配。Kim等[56]通過(guò)研究大腸桿菌中一條與磷酸吡哆醛合成相關(guān)的新代謝途徑與細(xì)胞已知代謝網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用發(fā)現(xiàn)：當(dāng)新的或外源途徑引入到已有的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)后，存在著多個(gè)層次的相互作用：1)新代謝產(chǎn)物與已有代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾；2)已有代謝產(chǎn)物與新代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾；3)新代謝途徑中酶的某些非特異性活性，造成某些中間代謝物和能量因子被消耗，同時(shí)新代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞已有調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的干擾等。異源系統(tǒng)中由于各種來(lái)源，不同特性的元件、模塊之間的不適配必然會(huì)存在類似的負(fù)相互作用，因此元件、模塊適配和重組系統(tǒng)調(diào)試是異源合成研究的新熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室在in silico代謝網(wǎng)絡(luò)分析及優(yōu)化的基礎(chǔ)上，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組芯片分析及基于13C標(biāo)記的代謝流量分析，可從不同層次上對(duì)異源合成模塊與宿主系統(tǒng)間的互作及適配機(jī)制進(jìn)行探討。例如，通過(guò)對(duì)6dEB在大腸桿菌中的異源合成進(jìn)行不同層次的考察，發(fā)現(xiàn)不同功能模塊之間在真實(shí)情形下與“理想情形”下 (細(xì)胞完全以產(chǎn)物合成為目標(biāo))存在較大的表型差異，包括轉(zhuǎn)錄水平及代謝水平上的整體差異，反映了不同模塊間確實(shí)存在適配性問(wèn)題，并直接影響了目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率。因此，通過(guò)對(duì)模塊內(nèi)與模塊間的相關(guān)基因進(jìn)行改造，縮小真實(shí)情形與“理想情形”的差異，改善模塊間的適配性問(wèn)題，是提高目標(biāo)產(chǎn)物異源合成效率的關(guān)鍵所在，也是本實(shí)驗(yàn)室正在開展的工作。

4 展望

隨著研究材料的豐富和理論方法與技術(shù)的不斷完善進(jìn)步，合成生物學(xué)技術(shù)將徹底變革傳統(tǒng)天然產(chǎn)物開發(fā)的研究思路，并最終實(shí)現(xiàn)珍稀天然產(chǎn)物的大規(guī)模制造和新化合物的發(fā)現(xiàn)。更多新天然元件的挖掘?qū)⑦M(jìn)一步拓展人類認(rèn)知與合成生物學(xué)應(yīng)用的范圍，豐富新合成生物學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建的生物磚，同時(shí)運(yùn)用新的元件也能夠改進(jìn)已有系統(tǒng)的效率，發(fā)揮系統(tǒng)優(yōu)化的作用。新的元件裝配和系統(tǒng)適配思路與方法的實(shí)施，也大大提升人工生命系統(tǒng)的性能與品質(zhì)。集成運(yùn)用以上方法后，異源產(chǎn)物的合成效率獲得了顯著的提升，許多珍貴的化合物產(chǎn)量由初始的毫克/升水平增加到了克/升，甚至幾十克/升。部分產(chǎn)品的工藝 (如青蒿酸)即將取代了原有的生產(chǎn)方式，正在進(jìn)行中試和工業(yè)規(guī)模的放大研究。因此從生物元件挖掘設(shè)計(jì)到模塊系統(tǒng)的組裝適配各方面的思路，方法與技術(shù)的革新，將全面促進(jìn)合成生物學(xué)技術(shù)發(fā)展與成熟。

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