郝雙影，許芳霞，李寬鈺

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇省醫(yī)學(xué)分子技術(shù)重點實驗室，江蘇 南京 210093

弗里德賴希共濟失調(diào) (Friedreich ataxia，F(xiàn)RDA) 是一種常染色體單基因突變引起的神經(jīng)退行性疾病，96%的病人是由于第9號染色體上frataxin (FXN) 基因的第一個內(nèi)含子中有 GAA序列大量重復(fù)擴增[1-2]，造成FXN蛋白表達(dá)減少，引起FRDA的線粒體疾病。FRDA病人的主要臨床表現(xiàn)為進行性姿勢和步態(tài)的共濟失調(diào)，上運動神經(jīng)元功能障礙，如構(gòu)音障礙、腱反射消失、深感覺喪失、心肌病、糖尿病及繼發(fā)性骨骼畸形等[3-4]。早期的研究結(jié)果顯示 FRDA病人包括3個主要的生化特點和病理生理學(xué)特征：細(xì)胞內(nèi)鐵的沉積[5]；線粒體內(nèi)含有鐵硫簇的酶缺陷[6]；在血液和尿液中存在氧化損傷的標(biāo)記[7]。研究發(fā)現(xiàn)全身敲除Fxn的小鼠模型是胚胎致死；而分別在肌肉和神經(jīng)組織突變后的小鼠模型則 FRDA癥狀加重。在knock-in (fxn-GAA)230小鼠模型中Fxn的表達(dá)量降低了 25%[8]，在 knock-inknock-out小鼠中 Fxn的表達(dá)量是野生型的25%～35%，但這些模型小鼠并沒有表現(xiàn)出明顯的病理特征。將小鼠內(nèi)源性的Fxn敲除，轉(zhuǎn)入第一個內(nèi)含子中GAA重復(fù)擴增的全長人源FXN的YAC轉(zhuǎn)基因小鼠 YG8R則輕微地出現(xiàn)了順烏頭酸酶活性降低、抗氧化能力降低，并伴有神經(jīng)退行性病變、心肌炎、協(xié)調(diào)能力降低、運動能力下降等癥狀[9]。因此，現(xiàn)存的幾種小鼠模型都無法完全模擬FRDA病人的病情。在病人中FXN突變首先在神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)出病變和損傷，而在其表達(dá)量較高、線粒體功能也很活躍的肝臟和腎臟等器官卻無明顯病癥[10]。目前有研究發(fā)現(xiàn)人 FXN含有3種亞型蛋白，它們的表達(dá)具有組織特異性，該亞型蛋白的表達(dá)可能與 FRDA病人的組織特異性病變機制有關(guān)[11]。為成功建立小鼠FRDA疾病模型，我們首先需要確定小鼠體內(nèi)Fxn亞型蛋白是否存在及其相應(yīng)的功能。因此高度敏感和特異性的小鼠 Fxn的抗體制備是我們首先要解決的問題。

本研究通過 PCR擴增、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子克隆方法構(gòu)建帶有 his6標(biāo)簽的鼠源Fxn融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過Ni-NTA柱子純化和透析得到的純化蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了能夠特異性識別內(nèi)源Fxn的多克隆抗體。高度特異和靈敏的 Fxn抗體的獲得為我們深入研究小鼠Fxn亞型蛋白的存在及其功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

純種雌性新西蘭大白兔購于青龍山兔場。大腸桿菌DH5α和BL21 (DE3) 及哺乳動物細(xì)胞系N2a和HEK293為本實驗室保存。T4 DNA連接酶試劑盒、限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；2×pfuMix購自南京博爾迪公司；DNA回收試劑盒、DNA抽提試劑盒購自天恩澤公司；麗春紅儲存液 (10×) 購于博士德公司；辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的羊抗兔IgG購自中杉金橋公司。亞甲基雙丙烯酰胺 (N,N-methylene diacrylamide，Bis)、過硫酸銨 (Ammonium persulfat)、四甲基乙二胺 (N,N,N',N'-tetramethy-lethylenediamine，TEMED) 和十二烷基磺酸鈉 (Sodium dodecyl sulfate，SDS) 購自 Amresco (USA)。預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) (Prestained seeBlue Plus 2)購自Invitrogen (USA)。底物發(fā)光試劑盒購自 Pierce(USA)。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)小鼠FxnmRNA序列設(shè)計并合成引物，引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點 (用下劃線表示)。正向引物為：F (5-CCGAATTC ATGGGCTTGGG GACATTGGACA-3)；反向引物為 R (5-CCGCT CGAG TGAAGTGCCTTTTCCAGAATA-3)。以小鼠FxncDNA為模板進行PCR反應(yīng)，用EcoRⅠ和XhoⅠ對擴增出的 DNA片段和含有 his6標(biāo)簽的質(zhì)粒pET24(+) 同時進行雙酶切，然后用連接試劑盒進行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并涂板，挑選單菌落，在 LB液體培養(yǎng)基中 37 ℃搖晃過夜，抽提質(zhì)粒 DNA，用EcoRⅠ和XhoⅠ對質(zhì)粒 DNA進行雙酶切鑒定，篩選出已插入正確基因片段的重組質(zhì)粒。經(jīng)序列檢測(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，成功獲得含正確mFxn序列的重組質(zhì)粒pET24(+)-mFxn。該質(zhì)粒將在大腸桿菌中表達(dá)沒有氨基端信號肽的130個氨基酸的蛋白，理論分子量為14.38 kDa。

1.2.2 融合蛋白的表達(dá)

將已含 pET24(+)-mFxn重組質(zhì)粒的 BL21(DE3) 菌液37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)到0.7～0.8時加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。分別于 0、1、2、3、4 h取 1 mL菌液，15 000 r/min、4 ℃離心 2 min，將沉淀懸浮于裂解緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0) 中，加上樣緩沖液后100 ℃ 加熱5 min，上清上樣用15% SDS-PAGE分離并用考馬斯亮藍(lán)染色。以實驗所獲得的最佳誘導(dǎo)時間進行大規(guī)模的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.3 融合蛋白的純化

將2 L經(jīng)大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心，沉淀懸浮于裂解緩沖液 (50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0) 中，超聲波粉碎后15 000 r/min、4 ℃ 離心15 min，將上清加入已預(yù)先平衡過的Ni-NTA柱中，過柱液收集備用。結(jié)合了 mFxn-his6融合蛋白的Ni-NTA 柱經(jīng)漂洗 (50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)，洗脫 (50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH 8.0)。收集的裂解液、過柱液、漂洗液和洗脫液經(jīng)15% SDS-PAGE分離后，考馬斯亮藍(lán)染色分析。

1.2.4 融合蛋白的透析

為了防止洗脫液中高濃度的咪唑?qū)γ庖咄米雍罂贵w產(chǎn)生的影響，我們利用透析的方式將其去除。合并含有融合蛋白的洗脫液，加入預(yù)平衡過的離心過濾裝置 (4 mL體系) 中，3 000 r/min、4 ℃離心 20 min，于過濾器中加入過濾液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl) 補齊至4 mL，3 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集離心管中的過濾液，備用。重復(fù)上述步驟9次，得到純化的透析過的mFxn融合蛋白。過濾液以及濃縮后的蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE分離后，考馬斯亮藍(lán)染色分析。

1.2.5 抗體的制備和純化

純化的蛋白1 mg與完全佐劑 (Sigma，USA)按照 1∶1體積乳化后預(yù)免疫新西蘭大白兔，兩周后，再將純化的蛋白 0.5 mg不完全佐劑按照1∶1體積乳化后進行第一次加強免疫，每隔兩周加強1次，共經(jīng)過3次加強免疫后收集血清。獲得的抗血清經(jīng)硫酸銨沉淀，得到初步純化的抗體，進行Western blotting、免疫熒光和免疫沉淀分析。

1.2.6 抗體效價及特異性的測定

抗體的效價通過ELISA測定。將Fxn和帶有his6標(biāo)簽的平行對照蛋白 ABCB10用 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 稀釋，以相同濃度的蛋白包被反應(yīng)板 (100 ng)。為了進一步檢測抗體的靈敏度，以不同濃度的蛋白包被反應(yīng)板(0.001～1 000 ng)，4 ℃過夜。棄去包被液，將板拍干，加入封閉液至滿孔，置37 ℃，封閉1 h，PBST洗板3次，將板拍干。純化后的抗體及免疫前血清分別按1∶500，1∶2 500，1∶12 500，1∶62 500，1∶312 500，1∶1 562 500，1∶7 812 500比例用稀釋液 (5%脫脂牛奶，0.05%吐溫-20) 稀釋，同時對于不同濃度包被的反應(yīng)孔，F(xiàn)xn抗體按照1∶5 000用稀釋液稀釋，免疫前血清1∶200稀釋作為陰性對照。將各溶液按每孔 100 μL體積加入已包被和封閉的反應(yīng)板中 (37 ℃，2 h)，用PBST洗板5次，每次1 min，將板拍干。加入 1∶10 000辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)抗體稀釋液100 μL，37 ℃，1 h，再用PBST洗板 5次，每次 1 min，將板拍干。加入100 μL TMB顯色液，于37 ℃下避光顯色30 min。用2 mol/L H2SO450 μL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定各孔OD450值，計算抗體效價和靈敏度。

通過Western blotting檢測抗體的特異性。不同量的mFxn純蛋白、N2a細(xì)胞和HEK293細(xì)胞裂解液以及小鼠組織抽提物經(jīng) 15% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色。脫色后，以1∶500稀釋Fxn抗體進行4 ℃孵育過夜，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，按照產(chǎn)品說明書，用HRP化學(xué)發(fā)光試劑盒進行檢測。

1.2.7 Fxn抗體在免疫沉淀 (Immunoprecipitation,IP) 中的應(yīng)用

為了檢測 Fxn抗體能否應(yīng)用于各類生化試驗中，我們利用protein G瓊脂糖珠進行IP檢測。首先，平衡過的瓊脂糖珠預(yù)清洗細(xì)胞和組織的抽提物 (4 ℃，2 h)，去除非特異性蛋白；同時抗體與瓊脂糖珠孵育 (比例為1∶5，4 ℃，2 h)；然后將預(yù)清洗過的細(xì)胞裂解液或抽提物與已經(jīng)結(jié)合抗體的瓊脂糖珠4 ℃ 共同孵育2 h。將預(yù)清洗的瓊脂糖珠，IP的過濾液 (Flowthrough) 以及IP后的樣品進行Western blotting分析。

1.2.8 Fxn抗體在細(xì)胞免疫熒光(Immunofluresence) 中的應(yīng)用

用終濃度為 125 nmol/L的 mitotracker(Invitrogen，USA) 染色細(xì)胞 40 min，1×PBS 洗兩遍后用多聚甲醛溶液固定貼壁培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，經(jīng) 0.2% Triton X-100部分裂解細(xì)胞，用 Fxn多克隆抗體為一抗，在 5%BSA/PBS中 4 ℃下過夜免疫染色內(nèi)源 FXN，1×PBS漂洗3次，以Alexa-fluor 488的羊抗兔IgG(Invitrogen，USA) 在室溫下黑暗處孵育1 h，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并用 OLYMPUS FLUOVIEW Ver.1.7a Viewer軟件中分析圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，切出的目的片段和載體片段與預(yù)期大小一致，經(jīng)測序分析，發(fā)現(xiàn)與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的mFxncDNA序列一致 GenBank Accession No.NM_008044。由此表明我們成功獲得了可表達(dá)帶his6標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET24(+)-mFxn。

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒 pET24(+)-mFxn轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) 誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。結(jié)果如圖1所示，隨著誘導(dǎo)時間的增加蛋白的表達(dá)逐漸加強，當(dāng)誘導(dǎo)時間為 2 h時已達(dá)到最高表達(dá)量 (圖 1，泳道4)。后續(xù)蛋白的大量制備以此為依據(jù)。

2.3 重組蛋白純化和抗原制備

將已成功轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的 BL21 (DE3)經(jīng)0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，收集2 L菌液，超聲破碎，經(jīng)過 Ni-NTA柱分離純化，洗脫產(chǎn)物經(jīng)15% SDS-PAGE膠分析如圖2A所示。被洗脫的蛋白峰主要集中在餾分1～3，隨著餾分增加，被洗脫的蛋白隨之減少。

為了獲得高純度的Fxn蛋白，將Ni-NTA柱純化后含有蛋白餾分的洗脫液合并 (圖 2A，泳道 E1～3)，用離心過濾裝置連續(xù)梯度透析，所收集的洗脫餾分如圖2B所示。目的蛋白被濃縮 (泳道P)，得到純化的Fxn-his6融合蛋白。

圖1 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)時相分析Fig. 1 Time course of his-tagged mouse Fxn expression. M: protein marker; 0?4: Coomassie Blue staining for his-tagged mFxn induced with 0.2 mmol/L IPTG for 0, 1, 2, 3, 4 hours in E. coli strain BL21(DE3).

圖2 帶his6標(biāo)簽的小鼠Fxn融合蛋白的純化、透析和濃縮Fig. 2 Purification, dialysis, and concentrate of recombinant his-tagged mouse Fxn. (A) Purification of recombinant his-tagged mFxn protein on Ni-NTA beads and detection with Coomassie Blue stained 15% SDS-PAGE. Lysate: the lysates; FT: flow-through; W: wash; elution fractions (E1?5) were analyzed on 15% SDS-PAGE. M: protein marker. (B)Dialysis and concentrate of his-tagged mFxn and detection with Coomassie Blue stain on 15% SDS-PAGE gel. M:protein marker; E: eluate; F1?9: filter-device flow-through; P: purified, dialysed, and concentrated protein.

2.4 抗體制備及純化

純化的 Fxn蛋白經(jīng)濃縮后與弗氏佐劑混合乳化并免疫 14～16周齡健康的雌性新西蘭大白兔，再經(jīng)過3次加強免疫，采取兔子心臟血獲得抗血清，經(jīng)硫酸銨沉淀，得到初步純化的Fxn抗體 (見抗體應(yīng)用部分)。

2.5 抗體特異性和靈敏度鑒定

為了測定該抗體的效價，我們利用 ELISA的方法，以一定濃度的抗原 (100 ng) 包被ELISA板，以500～7 812 500倍稀釋的抗體與之結(jié)合，平行對照蛋白為相同濃度的在大腸桿菌中表達(dá)的帶his6標(biāo)記的ABCB10。ELISA數(shù)據(jù)結(jié)果表明Fxn抗體效價達(dá)1.5×106以上 (圖3A)。

進一步特異性檢測試驗，以不同濃度的抗原Fxn (0.001～1 000 ng) 包被ELISA板，對照抗原仍為ABCB10，使用濃度與Fxn相同，以1∶5 000的稀釋倍數(shù)的抗體與之結(jié)合。結(jié)果表明，F(xiàn)xn抗體的特異性很高，相對親和力達(dá)1×10?5g/L，抗原濃度為 1×10?8g/L 時還可檢出 (圖 3B)。

為了驗證所制備抗體的質(zhì)量，排除 his6-tag可能產(chǎn)生的影響，應(yīng)用所獲得的多克隆抗體按照1∶500稀釋作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP) 羊抗兔IgG作為二抗，Western blotting檢測抗體識別不同量的純蛋白和細(xì)胞或小鼠組織內(nèi)源Fxn的表達(dá)量。如圖4A所示，F(xiàn)xn抗體檢測不到平行對照蛋白ABCB10-his6，但可輕易檢測到 4 ng的 Fxn蛋白，而相同濃度稀釋的 his6抗體兩種蛋白Fxn和ABCB10都檢測不到，當(dāng)?shù)鞍诐舛仍黾拥溅蘥級，his6標(biāo)記的Fxn和ABCB10均被檢出。圖4B顯示隨著Fxn純蛋白量的不斷減少，Western blotting檢測到的條帶由強變?nèi)酰?dāng)?shù)鞍琢繙p少到0.16 ng時 (圖4B，泳道4)，仍能夠檢測到Fxn蛋白的存在。

本實驗制備的抗體不僅可識別體外表達(dá)的免疫原純蛋白，而且也能識別小鼠細(xì)胞系 (N2a，圖4B泳道5) 和小鼠組織 (心臟，圖4B泳道7)的內(nèi)源性Fxn。該抗體還可以特異性地識別人源細(xì)胞系HEK293的內(nèi)源性FXN (圖4B，泳道6)。

圖3 ELISA檢測Fxn抗體的效價和特異性Fig. 3 Titration (A) and specificity (B) of Fxn antibody detected by ELISA.

圖4 Western blotting檢測Fxn抗體的滴度和特異性Fig. 4 Titration and specificity detection of polyclonal antibody of Fxn by Western blotting. (A) Exclusion of immunogenicity of his6 tag. Different amounts of purified protein are indicted. (B) The high sensitivity and specificity of purified antibody detected by Western blotting with different amount of purified Fxn protein and lysates from cell lines N2a and HEK293 or from mouse tissue heart. 1?4: 20, 4, 0.8, 0.16 ng of purified mouse Fxn protein. 5?7: cell lines N2a and HEK293, mouse tissue heart.

2.6 抗體的應(yīng)用

為了進一步檢驗該抗體除 Western blotting外是否可以用在其他研究工作中，我們檢測了該抗體在免疫沉淀和免疫熒光中的靈敏度與特異性。利用protein G瓊脂糖珠結(jié)合Fxn抗體，小鼠細(xì)胞系和組織裂解液為目標(biāo)蛋白來源。免疫沉淀結(jié)果表明Fxn抗體能有效地識別內(nèi)源性的Fxn并能從細(xì)胞或組織裂解液中把 Fxn分離出來(圖 5)。

FXN是一種重要的線粒體蛋白，作為鐵的伴侶分子，它可以調(diào)控線粒體內(nèi)鐵的動態(tài)平衡。為了從細(xì)胞水平證明自制的多克隆抗體的特異性和靈敏度 (in vivo)，應(yīng)用所獲得的抗體，我們對內(nèi)源 FXN進行了細(xì)胞內(nèi)的定位實驗。通過免疫熒光方法，可以清楚地觀察到 FXN定位于線粒體內(nèi) (比較圖6A、6B和6C)。

圖5 利用免疫沉淀的方法Fxn抗體能有效分離內(nèi)源性的小鼠FxnFig. 5 Isolation of endogenous mouse Fxn by Fxn polyclonal antibody with immunoprecipitation. Lysates extracted from cell line N2a and mouse tissues were applied. P: preclean of the lysates with protein G-coupled agarose beads; FT: flowthrough after IP; IP:IP sample; Ab: antibody alone; Fxn: purified protein mouse Fxn.

3 討論

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)帶有his6標(biāo)簽的Fxn的載體，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。高度純化的Fxn蛋白作為免疫原，免疫兔子得到抗Fxn的血清，純化后得到了高敏感性和高特異性的Fxn抗體。和其他商業(yè)銷售的抗體相比，其靈敏度要高出一個數(shù)量級以上 (數(shù)據(jù)未顯示)。針對以前使用的 FXN抗體只對人源樣品免疫印跡效果較好，對鼠源Fxn敏感性差的問題，本抗體的制備為利用小鼠模型研究FRDA疾病創(chuàng)造了有利的條件。

對 FRDA的研究在鐵代謝[12-15]、心血管疾病[13]、糖尿病[16]和神經(jīng)退行性疾病[13,17-18]等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注，其原因就是 FXN在線粒體的功能維持方面起到了重要作用，但其具體的功能還不是很確定。目前普遍接受的觀點是 FXN作為鐵伴侶分子，在鐵硫簇的合成過程中提供鐵，為線粒體電子傳遞鏈的正常進行提供必要的輔基[6,19-21]。我們的前期研究結(jié)果也表明FXN可以和與鐵硫簇合成相關(guān)的其他核心蛋白相互作用，有助于鐵硫簇的合成[11]。除了核心組分外，F(xiàn)XN很可能還與其他因子共同作用[22]。本抗體的產(chǎn)生將有助于鑒定新的與FXN相互作用蛋白，也有助于詮釋FXN蛋白的功能。

圖6 利用免疫熒光Fxn抗體能檢測位于線粒體中的內(nèi)源性FXNFig. 6 Mitochondrial localized FXN in HEK293 cells detected by immunoflurescence. HEK293 cells were co-stained with Mitotracker and Alexafluor488-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody against the primary antibody of Fxn.(A) Mitotracker for mitochondria (red). (B) Frataxin (green). (C) Merge for the colocalization of mitochondrial marker and FXN.

最近的GAA重復(fù)擴增介導(dǎo)的Fxn表達(dá)沉默的小鼠模型沒有體現(xiàn)FRDA病人的典型特征，加之GAA重復(fù)擴增的不穩(wěn)定性為FRDA疾病的研究帶來了瓶頸[23-25]。我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種新的 FXN亞型蛋白 (Ⅱ和Ⅲ型)特異性表達(dá)在病人受損嚴(yán)重的小腦和心臟組織中，增加心臟特異性的亞型蛋白Ⅲ的表達(dá)可以明顯增加線粒體順烏頭酸酶活性，增加小腦特異性的亞型蛋白Ⅱ的表達(dá)可以阻止細(xì)胞的氧化損傷[11]。這就預(yù)示了亞型蛋白的表達(dá)可能與 FRDA疾病的發(fā)病機制有關(guān)。該抗體的產(chǎn)生也將有助于小鼠體內(nèi)亞型蛋白的鑒定及其功能的檢測，為建立Fxn亞型蛋白缺失的FRDA小鼠模型奠定了基礎(chǔ)。

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