張志偉，吳勝

1 中國科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

在生物體內(nèi)，一個(gè)多步驟的生物合成途徑中往往存在一個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)受到多重水平的調(diào)節(jié)從而精確地控制目標(biāo)產(chǎn)物的合成[1-3]。目前，對(duì)生物合成途徑的改造，常規(guī)的做法是增加代謝途徑中受調(diào)蛋白基因的拷貝數(shù)，過量表達(dá)目標(biāo)蛋白。但這種對(duì)代謝途徑的改造方法很多時(shí)候并不奏效，原因可能是目標(biāo)蛋白的過量表達(dá)，往往會(huì)帶來非常嚴(yán)重的負(fù)面效應(yīng)。主要表現(xiàn)為：由于常規(guī)的蛋白質(zhì)表達(dá)是一種不完善的受控表達(dá)，只能啟動(dòng)，不能終止，表達(dá)的蛋白質(zhì)大部分在體內(nèi)形成包涵體，不僅是對(duì)生物體內(nèi)能量和物質(zhì)的巨大浪費(fèi)，而且造成細(xì)胞嚴(yán)重的生理負(fù)擔(dān)。針對(duì)上述問題，我們提出基于細(xì)菌群感效應(yīng)的基本原理及酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)設(shè)計(jì)一種分子開關(guān)，精確調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平，克服因蛋白過量表達(dá)帶來的一系列負(fù)面效應(yīng)，維持細(xì)胞正常的生理狀態(tài)，用于研究生物合成途徑的代謝節(jié)律以及促進(jìn)生物合成途徑高效運(yùn)轉(zhuǎn)。

細(xì)菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象最初是在海洋細(xì)菌費(fèi)氏弧菌Vibrio fischeri中發(fā)現(xiàn)的[4]。夏威夷短尾魷魚等魚類的特定器官中特殊共生體V. fischeri的細(xì)胞密度很高，達(dá)到1010～1011/mL，導(dǎo)致該器官發(fā)出熒光；而在海水中游離的V. fischeri，由于密度低于 102/mL，不能發(fā)出熒光[5-6]。這種細(xì)菌能夠感知其數(shù)量的變化，當(dāng)其密度達(dá)到一定閾值時(shí)才能發(fā)生的感應(yīng)現(xiàn)象稱為群感效應(yīng)[7]。后來的研究發(fā)現(xiàn)這種由細(xì)菌的細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息交流而引發(fā)的群體效應(yīng)，是由特殊的、微小的、可擴(kuò)散的化學(xué)分子介導(dǎo)的，這些分子被稱為自動(dòng)誘導(dǎo)物或信號(hào)分子。細(xì)菌正是通過產(chǎn)生、擴(kuò)散、檢測、感應(yīng)這種化學(xué)信號(hào)分子從而傳遞了信息，改變了它們之間的行為，顯示出單個(gè)細(xì)菌所不具有的生理功能和生態(tài)特征，包括弧菌調(diào)節(jié)生物發(fā)光、成群浮游形成生物膜現(xiàn)象、抗生素的生物合成等[8-10]。群體感應(yīng)同時(shí)也調(diào)控著動(dòng)植物致病菌的毒性因子的產(chǎn)生，而毒性因子的產(chǎn)生與這些細(xì)菌的致病性密切相關(guān)[11-12]。

革蘭氏陰性細(xì)菌V. fischeri的群感效應(yīng)是以LuxI-LuxR組成的系統(tǒng)進(jìn)行運(yùn)作的。LuxR是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，LuxI是信號(hào)分子合成酶，其中LuxI能夠自動(dòng)維持低水平地合成可以溶解的小分子信號(hào)分子 OHHL (N-3-oxohexanoy1-L-homoserinelactone)[13-14]。當(dāng)環(huán)境中細(xì)胞密度較低時(shí)，產(chǎn)生的少量信號(hào)分子不足以和LuxR結(jié)合，因而不能引發(fā)依賴LuxR的包含luxI基因在內(nèi)的熒光操縱子的大量轉(zhuǎn)錄。當(dāng)環(huán)境中細(xì)胞密度足夠大，信號(hào)分子濃度達(dá)到閾值時(shí)，OHHL就進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)和LuxR結(jié)合形成LuxR-OHHL復(fù)合物，此復(fù)合物結(jié)合到PluxI啟動(dòng)子上，使包括luxI基因在內(nèi)的熒光操縱子得到大量表達(dá)，生物體發(fā)光。同時(shí)，LuxI的增多進(jìn)一步促進(jìn) OHHL的合成，形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，使熒光功能性基因不斷地得到表達(dá)，V. fischeri就會(huì)發(fā)出明顯的熒光。此外，科學(xué)家也闡明了存在于銅綠假單胞菌和革蘭氏陽性細(xì)菌的群感效應(yīng)分子機(jī)制[15-19]。

由于群感效應(yīng)與細(xì)胞的致病性密切相關(guān)，因此尋找能夠抑制細(xì)菌群感效應(yīng)的方法 (即細(xì)菌群感猝滅) 對(duì)于防病治病具有重要的意義[20-22]。Zhang等首先從芽胞桿菌240B1中分離出了能夠降解AHL的酶AiiA，它是由aiiA基因編碼的250個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)保守的HXHXDH鋅指結(jié)構(gòu)[23]。2002年 Dong等和 Lee等相繼報(bào)道了在蘇云金芽胞桿菌的不同亞種中廣泛存在著aiiA基因，可能原因是蘇云金芽胞桿菌在自然生態(tài)系統(tǒng)中與革蘭氏陰性菌存在競爭關(guān)系[24-25]。通過對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)分子的內(nèi)酯環(huán)已被打開，由此可知 AiiA是一種AHL內(nèi)酯酶 (AHL lactonase)[26-27]。

群感效應(yīng)分子機(jī)制的闡明及相關(guān)元件的發(fā)現(xiàn)為人工設(shè)計(jì)微生物群落奠定了基礎(chǔ)[28-29]。Arnold等利用群感效應(yīng)設(shè)立了一個(gè)微生物生物系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)性自殺效應(yīng)可以使細(xì)胞濃度處于特定的水平[30]。Hasty等設(shè)計(jì)了一種同步遺傳振蕩器，利用細(xì)菌通過振蕩輸出信號(hào)的方式來構(gòu)建宏觀的生物感應(yīng)器，為進(jìn)一步為研究自然界發(fā)生的多細(xì)胞協(xié)調(diào)行為的機(jī)制提供了一個(gè)具體的模型系統(tǒng)[31]。本實(shí)驗(yàn)基于細(xì)菌群落中普遍存在的群感效應(yīng)的基本原理并結(jié)合酶催化的動(dòng)力學(xué)特征，首先在大腸桿菌群落中建立信號(hào)分子高絲氨酸內(nèi)酯 (AHL) 介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞交流機(jī)制，進(jìn)而通過控制環(huán)境中信號(hào)分子 AHL的濃度水平精確控制細(xì)胞中靶蛋白的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)靶蛋白的定時(shí)定量表達(dá)，為研究生物合成途徑的代謝節(jié)律以及促進(jìn)生物合成途徑高效運(yùn)轉(zhuǎn)提供一種分子工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 工具酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、ExTaqDNA聚合酶和 T4 DNA連接酶購于寶生物工程 (大連) 有限公司；基因組 DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)胞細(xì)菌總RNA提取試劑盒、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購于天根生化科技 (北京) 有限公司；KODTaqDNA聚合酶、SYBR Green Realtime PCR Master Mix購于日本TOYOBO公司；DNA凝膠回收試劑盒購于德國 QIAGEN公司；阿拉伯糖購于北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母膏、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?；N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone購于TCR試劑公司；海洋肉湯2216購自美國BD公司。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

蘇云金芽胞桿菌Bcillus thuringiensisCGMCC1.792購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；V. fischeriES114購于美國菌種保藏中心；pACYC-Duet-1購于Invitrogen公司；E. coliDH5α、E. coliTop10以及質(zhì)粒 pBAD/Myc-HisA、pET30-Egfp均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

BT培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉提取物3 g，NaCl 5 g，蒸餾水定容1 L，pH調(diào)為7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養(yǎng)時(shí)加1.5%瓊脂。VF培養(yǎng)基：37.4 g海洋肉湯2216溶于蒸餾水，定容至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

B. thuringiensis接種到BT培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h。V. fisheri接種到VF培養(yǎng)基中，26 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

菌株V. fischeriES114和B. thuringiensisCGMCC1.792的基因組DNA的提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書的方法操作。實(shí)驗(yàn)中所用的引物見表1，下劃線所示為限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中V. fischeriES114中l(wèi)ux系統(tǒng)基因序列 (GenBank Accession No.AY292966) 設(shè)計(jì)引物lux for和lux rev。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 1 min℃ ，53 ℃1 min，72 2 min℃ 。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ/Hind Ⅲ雙酶切后連接到質(zhì)粒pACYC-Duet-1的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pLux。根據(jù)啟動(dòng)子 PluxI、rbs序列和綠色熒光蛋白基因egfp序列設(shè)計(jì)一組引物，通過疊加延伸 PCR進(jìn)行 DNA片段拼接，獲得 PluxI-rbs-egfp的拼接片段。以 pET30-Egfp為模板，以egfpfor和egfprev為引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增；以所得基因片段為模板，以egfpfor2和egfprev為引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增；再以所得基因片段為模板，以egfpfor3和egfprev為引物進(jìn)行第 3輪擴(kuò)增，最終得到PluxI-rbs-egfp基因片段。該片段經(jīng)NdeⅠ/Hind Ⅲ雙酶切后連接到重組質(zhì)粒 pLux的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLPE (圖1)。該質(zhì)粒中包含用于靶基因egfp啟動(dòng)表達(dá)的全部元件。

以Bcillus thuringiensisCGMCC1.792基因組DNA為模板，簡并引物aiiAfor和aiiArev進(jìn)行℃ ，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 10 min PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為：95 5 min℃ ；95 ℃1 min，53 1 min ℃ ，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 10 min℃ ，72 1 min℃ 。PCR產(chǎn)物切膠回收后，用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，連接到經(jīng)同樣酶切處理的表達(dá)載體pBAD/Myc-HisA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAIIA(圖1)。該質(zhì)粒中包含用于終止靶基因egfp表達(dá)的全部元件。

表1 文中所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

圖1 質(zhì)粒pAIIA和pLPE圖譜Fig. 1 Map of plasmid pAIIA and pLPE.

1.2.3 AiiA蛋白質(zhì)表達(dá)以及活性檢測

將重組質(zhì)粒 pAIIA轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 Top10中，重組菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600等于0.6左右時(shí)，加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖，終濃度為1%，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h。離心除去上清液，細(xì)胞經(jīng)洗滌后超聲破碎，低溫離心后，取上清液用于SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)情況。

將1 mLE. coliTop10 (pAIIA) 菌體用生理鹽水洗滌 3次后用 495 μL反應(yīng)緩沖液和 5 μL AHL母液混合，AHL終濃度為2 mmol/L，37 ℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)液經(jīng)高速冷凍離心和微孔濾膜過濾處理，HPLC分析色譜柱為Waters C18反向色譜柱，柱溫為25 ℃。流動(dòng)相A液為ddH2O (其中添加終濃度為0.1%乙酸)，流動(dòng)相B液為色譜級(jí)乙腈。A液和 B液的比例為 32∶68。高絲氨酸內(nèi)酯及其產(chǎn)物保留時(shí)間分別為 4.9 min和3.9 min。酶的活力定義為每分鐘水解 1 μmol AHL所需的菌液。

1.2.4 熒光的鏡檢

取1 mL過夜培養(yǎng)的重組菌株E. coliTop10(pLPE) 菌液，以E. coliTop10菌液作對(duì)照，取2 μL菌液滴在干凈的載玻片上，用鑷子將蓋玻片放在樣品上，用吸水紙吸去多余的菌液，放于熒光顯微鏡下觀察，選用100×物鏡，10×目鏡，先在可見光投射下調(diào)出視野，觀察細(xì)胞形態(tài)及密度，拍照后關(guān)閉可見光，改換熒光，綠色熒光激發(fā)波長為485 nm，拍照保存。

1.2.5 熒光強(qiáng)度的測定

取不同實(shí)驗(yàn)條件下的重組菌株E. coliTop10(pLPE/pAIIA) 細(xì)胞培養(yǎng)液 200 μL置于96孔板，以E. coliTop10菌液作對(duì)照，測定樣品在485 nm下的吸光值，相同體積測定3次取平均值。定義相對(duì)熒光強(qiáng)度= (重組菌熒光強(qiáng)度-對(duì)照菌熒光強(qiáng)度)/對(duì)照菌熒光強(qiáng)度。

1.2.6 總RNA的提取及其反轉(zhuǎn)錄

不同實(shí)驗(yàn)條件下的重組菌株E. coliTop10(pLPE/pAIIA) 的總 RNA提取按細(xì)胞細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。以經(jīng)過 DNaseⅠ處理過的 RNA為模板，選取egfpfor1與egfprev1、rrsAfor與rrsArev 2對(duì)引物進(jìn)一步驗(yàn)證總RNA中有無DNA污染。經(jīng)驗(yàn)證后以無DNA污染的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照Quant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行 RT-PCR，反應(yīng)體系為：10×RT Mix 2 μL，Super Pure dNTPs(2.5 mmol/L each) 2 μL，Oligo(dT)152 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，RNase-Free ddH2O 12 μL，模板 RNA 1 μL，總體積 20 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃孵育60 min。

1.2.7 RT-qPCR

以E. coliTop10中rrsA基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)[32]，檢測基因片段大小均為 90 bp左右。按照 SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行 RT-qPCR。反應(yīng)體系為:2×SYBR mix 12.5 μL，cDNA 模板 1 μL，上下游引物各 0.25 μL，ddH2O 11 μL，總體積 25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán) 40 次。熔解曲線分析20 min，驗(yàn)證是否產(chǎn)生非特異性雙鏈DNA。每個(gè)樣品重復(fù)3次，RT-qPCR結(jié)果采用2－△△Ct方法對(duì)各個(gè)基因的Ct值進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子開關(guān)的設(shè)計(jì)理念及工作原理

與常規(guī)的靶蛋白過表達(dá)策略不同，分子開關(guān)的設(shè)計(jì)旨在精確控制細(xì)胞內(nèi)靶基因的蛋白表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)定量表達(dá)的目的，從而有助于研究生物合成途徑中關(guān)鍵酶不同的表達(dá)水平對(duì)該途徑代謝節(jié)律的影響，也可用于在細(xì)胞生長的特定階段關(guān)閉靶基因的表達(dá)，從而關(guān)閉靶基因所處的代謝通路。為此利用V. fischeriES114中參與群感效應(yīng)的Lux系統(tǒng)以及信號(hào)分子AHL降解酶等生物學(xué)元件設(shè)計(jì)一個(gè)可以操控靶基因蛋白表達(dá)水平的分子開關(guān)。圖2顯示了構(gòu)成分子開關(guān)的基本元件，工作原理如下：在細(xì)胞生長過程中，AHL合成酶編碼基因luxI轉(zhuǎn)錄，翻譯合成蛋白LuxI，后者合成信號(hào)分子 AHL。AHL可以自由出入細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間擴(kuò)散，當(dāng) AHL達(dá)到一定濃度時(shí)，與 LuxR調(diào)控蛋白結(jié)合形成復(fù)合物L(fēng)uxR-AHL，該復(fù)合物可以上調(diào) PluxI啟動(dòng)子控制下的基因轉(zhuǎn)錄，靶蛋白E合成速度加快，此時(shí)分子開關(guān)處于“on”狀態(tài)。當(dāng)需要終止目標(biāo)蛋白表達(dá)時(shí)，加入誘導(dǎo)物，啟動(dòng)aiiA轉(zhuǎn)錄，翻譯合成蛋白質(zhì)AHL內(nèi)酯酶，分解AHL，降低環(huán)境內(nèi)AHL的濃度，進(jìn)而導(dǎo)致LuxR-AHL復(fù)合物分離，解除上調(diào)效應(yīng)，此時(shí)分子開關(guān)處于“off”狀態(tài)。通過分子開關(guān)“on”和“off”狀態(tài)的切換，可以精確控制靶蛋白的表達(dá)水平。為了便于檢測分子開關(guān)的控制效果，我們選擇綠色熒光蛋白EGFP作為靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。此外，考慮到應(yīng)用的便捷性，我們?cè)O(shè)計(jì)將用于關(guān)閉靶基因的元件aiiA和 Lux系統(tǒng)置于同一細(xì)胞或不同細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢驗(yàn)分子開關(guān)對(duì)靶基因表達(dá)的實(shí)際控制效果。

圖2 “On”元件、“Off”元件置于同一細(xì)胞作用原理示意圖Fig. 2 Schematic diagram of molecular switch mechanism.

2.2 分子開關(guān)中“Off”元件的構(gòu)建

2.2.1 aiiA基因的克隆

將文獻(xiàn)報(bào)道一組功能確認(rèn)的aiiA基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌的不同亞種中廣泛存在著aiiA基因。根據(jù)同源比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)簡并引物aiiAfor和aiiArev，以B. thuringiensisCGMCC1.792基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到了一條753 bp的基因片段，該片段具有完整的開放閱讀框。將翻譯的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與芽胞桿菌240B1中分離到的AiiA氨基酸序列的同源性為90%。

2.2.2 aiiA基因在E. coli中表達(dá)及酶活性檢測

按照方法1.2.1描述成功構(gòu)建了質(zhì)粒pAIIA，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到E. coliTop10，加入L-阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集全細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。與未誘導(dǎo)細(xì)胞相比，誘導(dǎo)后的細(xì)胞明顯多出一個(gè)條帶，大小為28 kDa左右，與目的蛋白理論計(jì)算值相符，說明aiiA基因可以在E. coli中表達(dá) (圖 3)。

按照方法 1.2.2所示的方法檢測誘導(dǎo)后E. coliTop10 (pAIIA) 菌體的活性，反應(yīng)10 min，高速低溫離心除去細(xì)胞沉淀，上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾后，進(jìn)行HPLC檢測。底物AHL保留時(shí)間為 4.9 min，細(xì)胞與底物反應(yīng)生成的產(chǎn)物的保留時(shí)間為 3.9 min，檢測表明反應(yīng)液中底物全部耗盡。將產(chǎn)物進(jìn)行液質(zhì)分析，確定保留時(shí)間為3.9 min的物質(zhì)為底物AHL內(nèi)酯環(huán)水解后的產(chǎn)物(圖4)。上述結(jié)果表明誘導(dǎo)生成的AiiA蛋白具有催化活性，全細(xì)胞表現(xiàn)出的催化能力為200 μmol/(min·mL) 菌液。

圖3 aiiA基因在E. coli中表達(dá)的SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of aiiA gene expression in E. coli. M: protein marker; 1: induced E. coli BL21(pAIIA); 2: uninduced E. coli BL21 (pAIIA).

2.3 分子開關(guān)中“On”元件的構(gòu)建

為了便于檢測，本實(shí)驗(yàn)選擇綠色熒光蛋白EGFP為靶蛋白，將靶基因egfp置于啟動(dòng)子PluxI的控制之下，同時(shí)插入核糖體結(jié)合序列 rbs。詳細(xì)的構(gòu)建過程參見1.2.1。將重組質(zhì)粒pLPE轉(zhuǎn)入E. coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心肉眼可見菌體呈現(xiàn)亮綠色 (圖 5A)，通過熒光顯微鏡可看到細(xì)胞發(fā)出的綠色熒光 (圖5B)。

2.4 蛋白水平檢驗(yàn)分子開關(guān)對(duì)靶基因表達(dá)控制

圖4 AiiA蛋白催化活力分析Fig. 4 Analysis of AiiA protein catalytic activity. (A)HPLC analysis of AHL. (B) HPLC analysis of reaction product. (C) LC-MS analysis of reaction product.

圖5 重組菌株E. coli Top10 (pLPE) 熒光檢測Fig. 5 Fluorescence detection of recombinant strain E. coli Top10 (pLPE). (A) Image of the centrifugal cells.(B) Image of the cells observed by fluorescence microscope.

將分子開關(guān)“On”和“Off”元件設(shè)計(jì)在同一細(xì)胞中，也即將兩種質(zhì)粒pLPE和pAIIA轉(zhuǎn)入到同一個(gè)細(xì)胞，構(gòu)建重組菌E. coliTop10(pLPE/pAIIA)。將分子開關(guān)“On”和“Off”元件設(shè)計(jì)在不同細(xì)胞中，也即將兩種質(zhì)粒pLPE和pAIIA分別轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 Top10，混合培養(yǎng)E. coliTop10 (pLPE) 和E. coliTop10 (pAIIA)。E. coliTop10 (pLPE/pAIIA) 以及混菌分別接種到含有30 μg/mL氯霉素和100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按0.2%轉(zhuǎn)種量加入到新鮮的100 mL含抗生素的LB培養(yǎng)基中。為了檢驗(yàn)分子開關(guān)控制EGFP表達(dá)效果，分別選擇培養(yǎng)初期 (0 h)、對(duì)數(shù)生長中期 (5 h)加入 1% L-阿拉伯糖誘導(dǎo)物啟動(dòng) AHL降解酶AiiA的表達(dá)，以不添加任何誘導(dǎo)物的培養(yǎng)物為對(duì)照。定時(shí)取樣，測定細(xì)胞密度 (OD600)，繪制生長曲線。為準(zhǔn)確比較細(xì)胞內(nèi)靶蛋白EGFP的蛋白表達(dá)水平，將每份樣品都稀釋到OD600=0.2，用多功能酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度。每個(gè)樣品測3組平行，計(jì)算平均值。圖 6A和圖 6B顯示的分別是重組菌E. coliTop10 (pLPE/pAIIA) 和混菌(E. coliTop10 (pLPE) 和E. coliTop10 (pAIIA))的細(xì)胞生長情況以及分子開關(guān)對(duì)EGFP表達(dá)的控制效果。

圖 6 重組菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長曲線及EGFP表達(dá)檢測Fig. 6 Growth curve and expressed EGFP fluorescence intensity testing of E. coli Top10 (pLPE/pAIIA) (A) and mixture culture of E. coli Top10 (pLPE) and E. coli Top10 (pAIIA) (B) under the different experimental conditions. 1: uninduced; 2: induced at 5 h; 3: induced at 0 h.

從圖6A中可見，E. coliTop10 (pLPE/pAIIA)培養(yǎng)過程中，如果不添加誘導(dǎo)劑阿拉伯糖時(shí)，分子開關(guān)一直處于“On”狀態(tài)，EGFP的蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞的生產(chǎn)曲線呈正相關(guān)性。在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，EGFP的表達(dá)也呈現(xiàn)快速增加，細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，EGFP的相對(duì)熒光強(qiáng)度不再增加，維持在10.5左右。如果在細(xì)胞生長初期就加入誘導(dǎo)劑，由于AHL降解酶AiiA的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞在生長過程中合成的信號(hào)分子 AHL被快速分解，EGFP的表達(dá)在整個(gè)生長周期中處于非常低的水平，此時(shí)分子開關(guān)處于“Off”狀態(tài)。在細(xì)胞生長5 h后加入誘導(dǎo)物，可以看到前5 h，EGFP的表達(dá)與細(xì)胞生產(chǎn)曲線呈正相關(guān)性，此后盡管細(xì)胞繼續(xù)生長進(jìn)入對(duì)數(shù)生長后期以及穩(wěn)定期，但EGFP的相對(duì)熒光強(qiáng)度基本維持不變。由此可見靶基因的表達(dá)的開啟與細(xì)胞的生長周期密切相關(guān)，受群感效應(yīng)控制，而一旦加入誘導(dǎo)物，可以迅速靈敏地終止靶基因表達(dá)。

從圖 6B中可見，E.coliTop10 (pLPE) 和E. coliTop10 (pAIIA) 混合培養(yǎng)時(shí)，盡管AiiA的表達(dá)與靶基因的表達(dá)不在處于同一細(xì)胞，然而只要啟動(dòng) AiiA的表達(dá)也可以快速關(guān)閉靶基因的表達(dá)，這與信號(hào)分子 AHL可以在細(xì)胞間自由擴(kuò)散直接相關(guān)。

由此可見，無論將分子開關(guān)中“On”元件、“Off”元件置于同一細(xì)胞亦或是不同細(xì)胞中，只需通過控制加入誘導(dǎo)劑的時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)線性定量控制靶蛋白的表達(dá)水平。該分子開關(guān)具有便捷、靈敏、高效的特點(diǎn)。

2.5 mRNA水平檢驗(yàn)分子開關(guān)控制效果

以上結(jié)果是從蛋白質(zhì)水平上評(píng)估分子開關(guān)調(diào)控目標(biāo)蛋白表達(dá)的效果，為進(jìn)一步研究該分子開關(guān)的調(diào)控效果，通過 RT-qPCR技術(shù)檢測分子開關(guān)中靶基因egfp的轉(zhuǎn)錄水平。

E. coliTop10 (pLPE/pAIIA) 在培養(yǎng)過程中，分別在0 h和3 h加入誘導(dǎo)物，以不加誘導(dǎo)物作為對(duì)照。在細(xì)胞培養(yǎng)過程的不同時(shí)間點(diǎn) (2 h、3 h、3.2 h、3.4 h、3.6 h、4 h 和 10 h) 取樣，稀釋至相同濃度 (OD600=0.1) 后，提取mRNA，檢驗(yàn)無DNA污染后，通過RT-qPCR檢查egfp基因的轉(zhuǎn)錄水平，選定大腸桿菌的rrsA基因?yàn)閮?nèi)參基因。圖7顯示的是egfp基因分別在不添加誘導(dǎo)物，以及0 h和3 h時(shí)添加誘導(dǎo)物后實(shí)時(shí)檢測其mRNA水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖可見，在細(xì)胞培養(yǎng)過程不誘導(dǎo)情況下，egfp基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在2 h到4 h之間不斷提高，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，合成代謝較旺盛，基因轉(zhuǎn)錄水平較高。10 h時(shí)細(xì)胞處于生長穩(wěn)定期，合成代謝降低，基因轉(zhuǎn)錄水平也相應(yīng)降低。細(xì)胞生長初期 (0 h) 時(shí)加入誘導(dǎo)物，AiiA開始表達(dá)，致使AHL信號(hào)分子濃度達(dá)不到與調(diào)控蛋白LuxR結(jié)合所需的閾值，所以egfp基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平維持在較低的本底水平。細(xì)胞培養(yǎng)3 h后誘導(dǎo)的情況下，egfp基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在3.2 h比在3 h有所提高，之后逐漸下降。因?yàn)閯偧尤胝T導(dǎo)劑，AiiA蛋白的表達(dá)需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，且此時(shí)合成的 AiiA蛋白較少，AHL信號(hào)分子的合成速度大于降解速度，所以加入誘導(dǎo)劑初期egfp基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平依舊會(huì)有所提高。當(dāng)細(xì)胞合成較多的 AiiA蛋白，細(xì)胞中信號(hào)分子濃度降低，解除上調(diào)效應(yīng)，egfp基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分子開關(guān)對(duì)靶基因蛋白表達(dá)水平的控制是通過間接控制細(xì)胞中靶基因mRNA水平實(shí)現(xiàn)的。

圖7 不同培養(yǎng)條件下egfp基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測Fig. 7 Analysis of the transcriptional level of egfp under the different culture conditions.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于細(xì)菌群落中普遍存在的群感效應(yīng)的基本原理并結(jié)合酶催化的動(dòng)力學(xué)特征構(gòu)建了一種分子開關(guān)，并對(duì)該分子開關(guān)調(diào)控目的蛋白表達(dá)的效果進(jìn)行了評(píng)估。通過細(xì)菌的群感效應(yīng)啟動(dòng)靶基因表達(dá)，通過降解信號(hào)分子AHL的群感淬滅效應(yīng)終止靶基因表達(dá)。不論將構(gòu)成分子開關(guān)的“On”元件和“Off”元件設(shè)計(jì)在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，還是設(shè)計(jì)在獨(dú)立的細(xì)胞中，分子開關(guān)都可以有效地調(diào)控目標(biāo)蛋白的表達(dá)。只需通過控制加入誘導(dǎo)劑的時(shí)間，就可以實(shí)現(xiàn)線性定量控制靶蛋白的表達(dá)水平。該分子開關(guān)具有便捷、靈敏、高效的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分子開關(guān)有助于研究生物合成途徑中關(guān)鍵酶不同的表達(dá)水平對(duì)該途徑代謝節(jié)律，也可用于在細(xì)胞生長的特定階段關(guān)閉靶基因的表達(dá)，從而關(guān)閉靶基因所處的代謝通路。

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