謝貽，歐陽(yáng)浩淼，黃日波，陳東，金城

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 廣西科學(xué)院非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心 廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007

β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase, EC3.2.1.21)在自然界分布廣泛，可催化水解 β-D-葡萄糖苷鍵，參與生物體的糖代謝，在人類、動(dòng)植物和微生物的糖類代謝方面具有非常重要的價(jià)值[1-2]。

β-葡萄糖苷酶可以廣泛應(yīng)用于多種工業(yè)領(lǐng)域，如在纖維素的降解中，輔助外切纖維素酶和內(nèi)切纖維素酶將纖維素降解為葡萄糖單糖；在食品工業(yè)中作為食品改良劑，水解果汁飲料、酒、茶葉等中的芳香基糖苷類化合物，釋放風(fēng)味前體物質(zhì)，使香氣更加濃郁協(xié)調(diào)，顯著提高風(fēng)味；在工業(yè)中，制備有活性的中藥成分，生產(chǎn)低聚龍膽糖、表面活性劑[3-4]；同時(shí)，與其他酶協(xié)同作用生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白等，應(yīng)用于飼料工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域。因此，尋找新的 β-葡萄糖苷酶具有重要意義。

煙曲霉是自然界普遍存在的一種腐生真菌，是已知真菌中唯一能在 30～55 ℃的范圍內(nèi)正常生長(zhǎng)的真菌，也是目前已知的熱耐受性最高的真核生物，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道證明煙曲霉產(chǎn)生的多種酶均具有較好的熱穩(wěn)定性，如幾丁質(zhì)酶、植酸酶等[5-6]。因此，煙曲霉是一種非常好的工業(yè)用酶來(lái)源。

本研究克隆并表達(dá)了煙曲霉基因組中注釋的β-葡萄糖苷酶編碼基因bgl(AFUA_8G06970)，對(duì)重組蛋白的分析證明該基因編碼的蛋白是一個(gè)熱穩(wěn)定性較好的、新型β-葡萄糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

煙曲霉Aspergillus fumigatusYJ-407由中國(guó)微生物保藏中心保存 (CGMCC 0386)，表達(dá)載體 pGEX-4T-1購(gòu)自 Invitrogen公司，克隆載體pEASY-T1及大腸桿菌 DH5α和 BL21(DE3) 購(gòu)自Transgen公司。

1.1.2 主要試劑和儀器

質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Fermentas公司；DNA聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；用于酶學(xué)分析的底物均購(gòu)自Sigma公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。GSTrap FF Column (GE公司)，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) (南京新辰生物科技有限公司)；DU800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (Beckman公司)；蛋白電泳相關(guān)設(shè)備 (Bio-Rad公司)。

1.2 煙曲霉基因組DNA的提取

將煙曲霉孢子接種于完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后收集菌絲，菌絲加液氮研磨成細(xì)粉，用苯酚-氯仿法提取基因組DNA。

1.3 目的基因的克隆

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中預(yù)測(cè)的β-葡萄糖苷酶基因序列，用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物 (Forward primer: 5'-GCGTCGAC TCATGAGACAGTGCG GTGAGTTG-3'；Reverse primer: 5'-ATTTGCGG CCG CCTACTTGGACATCCTCGATGAC-3')，并在其上下游引入酶切位點(diǎn)SalⅠ和NotⅠ (下劃線部分所示)。

1.3.2 bgl基因的擴(kuò)增和TA克隆

PCR反應(yīng)采用 25 μL體系，反應(yīng)條件為：95 5 min℃ ，30個(gè)循環(huán)；72 10 min℃ ；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 2 min℃ 。PCR產(chǎn)物純化后與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選出陽(yáng)性克隆，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

pEASY-bgl和 pGEX-4T-1通過(guò)SalⅠ與NotⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，16 ℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化 DH5α，通過(guò)酶切驗(yàn)證，最終得到表達(dá)載體pGEX-bgl。

1.5 重組載體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

pGEX-bgl轉(zhuǎn)化至E. coliBL21(DE3)，用七葉苷平板法快速篩選具有β-葡萄糖苷酶活性的重組菌株[7]。37 ℃過(guò)夜的培養(yǎng)物以轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，200 r/min培養(yǎng)2～3 h，加入異丙基-β-D- 硫 代 半 乳 糖 苷 (IPTG, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 于 16 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

1.6 親和層析純化及產(chǎn)物鑒定

將培養(yǎng)液5 000 r/min離心20 min，收集菌體，重懸于 1×PBS中，冰浴超聲裂解，離心收集上清。用GE公司的 GSTrap FF column (5 mL預(yù)裝重力柱) 于 AKTA Purifier 層析系統(tǒng)中純化上清中的重組蛋白。純化的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色，觀察結(jié)果，并切取目的條帶，經(jīng)脫色、還原和烷基化后，膠內(nèi)胰蛋白酶酶解，進(jìn)一步處理后的肽提取液進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)[8]。蛋白質(zhì)定量采用Bradford法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[9]。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)分析

以七葉苷作為底物，采用DNS比色法測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性[10]。70 μL 0.1 mol/L 檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中，加入20 μL 1%的七葉苷和10 μL酶液，在一定溫度和pH下反應(yīng)10 min，立即加入100 μL DNS試劑，沸水浴5 min，流水冷卻至室溫，在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)吸光度，以相同處理的滅活酶作空白對(duì)照。一個(gè)酶活力單位(Unit)定義為每分鐘催化 1 μmol還原糖生成所需的酶量。所有酶活測(cè)定結(jié)果為 3次重復(fù)平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。

1.7.1 溫度對(duì)酶活力的影響

在 25～65 ℃范圍內(nèi)分別測(cè)定酶活力，反應(yīng)條件為pH 5.8，10 min，以最高活力為100%。熱穩(wěn)定性測(cè)定：在最適pH下，將濃度為0.2 mg/mL的酶分別于45 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃下水浴保溫0.5 h、1 h、2 h和 4 h后，加入底物于 45 ℃，pH 5.8測(cè)定殘留活力，以未處理的酶活力為100%，作溫度穩(wěn)定性曲線。

1.7.2 pH對(duì)酶活力的影響

在45 ℃下測(cè)定pH值的變化對(duì)酶活力的影響，以最高活力為 100%，作 pH曲線。pH 穩(wěn)定性的分析：在 4 ℃條件下將酶在不同 pH值(pH 2～8) 的緩沖液中處理過(guò)夜，然后在最適條件下測(cè)定酶活，以未處理的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，以研究其pH穩(wěn)定性。

1.7.3 酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以不同濃度的七葉苷為底物在最適條件下反應(yīng) 5 min，采用雙倒數(shù)作圖法 (Line weaver?Burk) 計(jì)算Km及Vmax值。

1.7.4 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

在酶促反應(yīng)中加入不同的金屬離子 (終濃度1 mmol/L) 和相關(guān)化學(xué)試劑 (終濃度 5 mmol/L)在最適條件下反應(yīng)，研究其對(duì)酶活性的影響。以未加金屬離子和化學(xué)試劑的反應(yīng)體系為正對(duì)照，計(jì)算其他各處理樣品的相對(duì)酶活力。

1.7.5 酶的底物特異性

采用水楊苷、熊果苷、羧甲基纖維素鈉、葡聚糖、纖維二糖為底物，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下反應(yīng)10 min，用DNS法或葡萄糖氧化酶法測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。同時(shí)，以pNPG、pNPC、pNPX、oNPG為底物[11]，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下反應(yīng)10 min，測(cè)定405 nm吸光值，根據(jù) pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。一個(gè)酶活力單位 (Unit) 定義為：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol pNP所需要的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 bgl的克隆和序列測(cè)定

通過(guò) PCR 方法擴(kuò)增到bgl的編碼框全長(zhǎng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)一條約 1.7 kb 的 DNA 片段 (圖 1A)，該片段與預(yù)期 PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度一致，說(shuō)明已成功擴(kuò)增出目的基因。連接T載體后的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定，序列與 GenBank 上的bgl基因片段完全相同。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及活性菌株篩選

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及表達(dá)載體的酶切鑒定Fig. 1 Amplification of the gene bgl and construction of expression vector. (A) M: DNA marker; 1: bgl. (B)M: DNA marker; 1: pGEX-bgl digested with SalⅠand NotⅠ.

按照材料和方法中所述構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-bgl。重組質(zhì)粒酶切得到約 5 kb的pGEX-4T-1線性片段和約 1.7 kb的插入片段，證明已經(jīng)成功構(gòu)建出原核表達(dá)載體 (圖1B)。將pGEX-bgl轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，經(jīng)初篩和復(fù)篩，選擇在七葉苷平板上能產(chǎn)生黑色活性圈的 β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌 (圖2)。

2.3 重組蛋白的表達(dá)和純化

圖2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶陽(yáng)性菌株的篩選Fig.2 Screening of β-glucosidase positive clones on Esculin agar plates.

對(duì)誘導(dǎo)進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇以下條件：過(guò)夜培養(yǎng)菌液次日以 1:100體積比接種 LB培養(yǎng)基于37 ℃，放大培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)以終濃度為0.4 mmol/L IPTG，于16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)24 h。誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白經(jīng)親和層析純化，獲得一個(gè)分子量約為 65 kDa的蛋白 (圖 3A)，與理論值相符。進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定 (圖3B)，證明所純化的重組蛋白為bgl基因編碼的蛋白。

圖3 重組β-葡萄糖苷酶純化的SDS-PAGE和質(zhì)譜檢測(cè)題Fig. 3 Identification of recombinant protein by SDS-PAGE and mass spectrometry analysis. (A) SDS-PAGE analysis of the purified Bgl. M: prestained protein marker; 1: purified recombinant protein Bgl. (B) Mass spectrogram results of Bgl. peak 1 matched peptides of ‘‘FNDNFGVPR’’; peak 2 matched peptides of ‘‘SLFDLVDFVSSR’’; peak 3 matched peptides of ‘‘IVLTHFADR’’; peak 4 matched peptides of ‘‘TDLSDQLFDTPR’’.

2.4 純化重組酶的性質(zhì)

2.4.1 溫度對(duì)酶活力的影響

該重組酶以七葉苷為底物的最適反應(yīng)溫度為45 ℃，在25～40 ℃及50～60 ℃之間約有70%～80%的活性，65 ℃時(shí)僅表現(xiàn)出約 50%的活性 (圖4A)。純化的β-葡萄糖苷酶在最適溫度45 ℃活性保持穩(wěn)定；70 ℃ 處理 1 h，其酶活殘留 80%以上，處理2 h，酶活性保持60%左右，處理4 h后酶活性殘留10%。80 ℃處理0.5 h，酶活保持50%以上 (圖4B)，表明該酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖4 溫度對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of temperature on activities and stabilities of recombinant enzyme. (A) The optimal temperature of the Bgl was estimated at various temperatures (25 ℃?65 ℃) in sodium hydrogen phosphate-citric acid buffer(100 mmol/L, pH 5.8). (B) Purified enzyme (0.2 mg/mL)was incubated in different conditions (45 ℃, 60 ℃,70 ℃, 80 ℃ at optimal pH) for time 0.5 h, 1 h, 2 h, and 4 h. The activity of enzyme without pre-incubation was taken as 100%. Results are the average of three replicates.

2.4.2 pH對(duì)酶活力的影響

以檸檬酸-Na2HPO4體系作為緩沖液，酶活測(cè)定結(jié)果表明，酶于45℃時(shí)的最適pH在5.5～6.0之間 (圖5A)，屬于酸性酶。pH穩(wěn)定性分析 (圖5B) 顯示，該酶在pH值4～6范圍內(nèi)較穩(wěn)定，超出這一范圍后，活性迅速下降。

圖5 pH對(duì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of pH on activities and stabilities of recombinant enzyme. (A) The optimal pH of the Bgl was estimated at various pH (3.0?8.0). (B) Purified enzyme was incubated at different pH (2.0?8.0) for 12 h, and the maximum activity was taken as 100%.

圖6 β-葡萄糖苷酶水解七葉苷的酶動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 6 Kinetic curve of Esculin hydrolyzed by recombinant enzyme.

2.4.3 酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)

重組酶在 45 ℃催化七葉苷水解時(shí)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km及Vmax值分別為 17.7 mmol/L和116 μmol/(min·mg)。

2.4.4 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響

結(jié)果表明，Na+和Ca2+對(duì)重組酶有輕微的激活作用，Co2+和 Mg2+對(duì)酶促反應(yīng)有不同程度的抑制作用，當(dāng)反應(yīng)體系中含有5 mmol/L的SDS時(shí)，酶已基本失去活性(圖7)。

2.4.5 底物特異性

分析了重組酶對(duì)多種底物的活性 (表 1)，發(fā)現(xiàn)重組 β-葡萄糖苷酶對(duì)七葉苷具有較高的活性，對(duì)水楊苷和纖維二糖活性相對(duì)較弱，而對(duì)其他底物分解能力很弱或不可測(cè)出。

圖7 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響Fig. 7 Effect of different metal ions and chemical reagents on Bgl activity. Results are the mean of three replicates.

表1 β-葡萄糖苷酶的底物特異性Table 1 Hydrolytic specific activities of purified Bgl on various substrates

3 討論

根據(jù)氨基酸序列和CAZY數(shù)據(jù)庫(kù)的信息[12]，本研究克隆表達(dá)的蛋白隸屬于糖苷水解酶家族(Glycoside Hydrolysis Family)1。經(jīng) SWISSMODEL結(jié)構(gòu)模擬分析，該酶與來(lái)源于黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium[13-14]的BGL1A具有30%的相似性；與土曲霉Aspergillus terreusβ-葡萄糖苷酶 (XP_001211835) 的同源性為 68%。同時(shí)與多種真菌，如里氏木霉Trichoderma reesei來(lái)源的GH1葡萄糖苷酶多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該酶具有兩個(gè)與催化活性有關(guān)Glu保守殘基。

已報(bào)道的 β-葡萄糖苷酶最適溫度在30～110 ℃之間，多為酸性酶 (表2)，我們得到的重組酶最適溫度和最適 pH也在此范圍內(nèi)變化。值得一提的是，煙曲霉Bgl在70 ℃保溫1 h后仍可保留 80%以上的酶活性；80 ℃處理0.5 h，酶活保持在50%以上。因此，該酶在目前已報(bào)道的真菌GH1家族的β-葡萄糖苷酶中是熱穩(wěn)定性最高的。

目前已報(bào)道的 β-葡萄糖苷酶大多可以分解纖維二糖，而Neosartorya fischeri來(lái)源的酶能有效分解槲皮黃酮葡萄糖苷、染料木黃酮等，卻不能分解纖維二糖、三糖和四糖；還有的酶分別對(duì)七葉苷、水楊苷等水解能力較強(qiáng) (表 2)。對(duì)煙曲霉 Bgl的底物特異性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該酶對(duì)七葉苷活性最高，對(duì)水楊苷和纖維二糖有一定活性，但對(duì)其他商品化底物則沒(méi)有活性，與其他來(lái)源的 β-葡萄糖苷酶的底物特異性存在較大差異。由于所測(cè)試的底物有限，尚難以確定煙曲霉Bgl的天然底物，仍需進(jìn)一步的深入研究。

表2 不同來(lái)源β-葡萄糖苷酶的部分酶學(xué)性質(zhì)Table 2 Properties of recombinant BGLs from various sources

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