徐美珍，任杰，龔勁松，董文玥，吳洽慶，許正宏，朱敦明

1 江南大學醫(yī)藥學院制藥工程研究室，江蘇 無錫 214122

2 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308

生物催化3-(4-氯苯基)-戊二腈去對稱性水解合成光學純巴氯芬的關鍵前體

徐美珍1，任杰2，龔勁松1，董文玥2，吳洽慶2，許正宏1，朱敦明2

1 江南大學醫(yī)藥學院制藥工程研究室，江蘇 無錫 214122

2 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308

徐美珍, 任杰, 龔勁松, 等. 生物催化 3-(4-氯苯基)-戊二腈去對稱性水解合成光學純巴氯芬的關鍵前體. 生物工程學報, 2013, 29(1): 31?40.

Xu MZ, Ren J, Gong JS, et al. Biocatalytic desymmetric hydrolysis of 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile to the key precursor of optically pure baclofen. Chin J Biotech, 2013, 29(1): 31?40.

研究了利用生物催化劑制備 (S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸。以3-(4-氯苯基)-戊二腈為底物，采用苯酚-次氯酸鈉法對實驗室保藏的菌株進行篩選，得到一株產物立體選擇性較高的菌株赤霉菌Gibberella intermediaWX12，并對其催化特性和發(fā)酵條件進行了初步研究。以30 g/L的乳糖和20 g/L的蛋白胨分別為碳、氮源，發(fā)酵培養(yǎng)96 h，收集的菌體在50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 8.0) 中30 ℃催化反應24 h，將3-(4-氯苯基)-戊二腈轉化為4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸，產率為90%。將產物化學轉化為巴氯芬，手性HPLC分析表明水解產物構型是 (S)，其對映異構體過量值ee＞99%。該產物可以用來合成光學純的 (R)-和(S)-巴氯芬。

腈水解酶，3-(4-氯苯基)-戊二腈，4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸，巴氯芬

腈類化合物 (R-CN) 是有機合成中的重要中間體[1]，它的水解反應被廣泛應用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成[2-3]，在有機合成中占有極其重要的地位，腈水解的方法主要有化學水解法和生物轉化法[4-6]。腈的傳統(tǒng)化學水解需要強酸或強堿、高溫、高壓等反應條件，生產成本高，而且副產物多，產量低，環(huán)境污染嚴重；相反，生物轉化法反應條件溫和，環(huán)境污染小，并具有良好的化學選擇性[7]、區(qū)域選擇性[8]和對映選擇性[9]等優(yōu)點。

巴氯芬 (Baclofen)，商品名力奧來素(Lioresa1)，化學名β-4-氯苯基-γ-氨基丁酸，是γ-氨基丁酸的取代衍生物，曾作為肌松藥用于臨床，后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)咳、抗癲癇、治療頑固性呃逆、中風及脊髓損傷引起的疼痛、三叉神經痛等臨床作用[10-11]。巴氯芬是一種手性藥物，存在一對對映異構體，據文獻報道，(R)-巴氯芬的活性是 (S)-巴氯芬的100倍[11]。但由于光學純的巴氯芬的合成成本較高，目前市場上的巴氯芬藥品仍是消旋體。

目前，光學純巴氯芬的合成方法主要集中于化學合成[12-15]、手性拆分[16-18]以及酶催化-化學合成[19-20]?；瘜W水解方法通常需要高溫、強酸、強堿條件，并伴隨有大量鹽類形成，給分離純化帶來困難，也造成一定的環(huán)境污染；而酶法水解則具有高效性、高選擇性、反應條件溫和、環(huán)境污染小、成本低、產物光學純度高等優(yōu)點，這符合原子經濟性和綠色化學發(fā)展的要求。另外，化學法很難實現(xiàn)二腈到單腈單酸的選擇性水解，而酶法卻可輕易完成該反應，故將傳統(tǒng)的有機合成與生物催化結合的方法 (化學-酶法) 在手性醫(yī)藥中間體合成方面顯示了巨大的優(yōu)勢[21]。而到目前為止，對腈的區(qū)域和立體選擇性生物轉化反應的研究還比較少，特別是以潛手性的二腈為底物，生物轉化生成光學活性的單氰基羧酸化合物的反應更是稀少。王梅祥等[20]利用紅球菌Rhodococcussp. AJ270 細胞在催化轉化72 h后實現(xiàn)了3-(4-氯苯基)-戊二腈的選擇性水解，生成的產物為 (S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸，轉化產物ee值為26%，在體系中添加丙酮后ee提高至63%。

本文從腈水解酶產生菌株的篩選入手，得到一株能將底物 3-(4-氯苯基)-戊二腈去對稱性水解成S構型的4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸的菌株，并對其催化性能進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：牛肉膏10，葡萄糖25，酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5。pH 7.0，115 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：乳糖30，蛋白胨 10，NaCl 1.16，MgSO4·7H2O 0.12，KH2PO42.72，己內酰胺 2.26。pH 7.0，115 ℃滅菌 20 min。

1.1.2 主要試劑和儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒，GHP-9270)；恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海智城，ZHWY-200D)；超凈工作臺 (蘇凈安泰，SW-CJ-1FD)；1260型高效液相色譜儀 (HPLC) 為 Agilent Technologies公司產品；手性分離柱Crownpak CR[+]和IB均為 DAICEL公司產品。蛋白胨、酵母粉為美國BD 公司產品；戊酸、丁二酸、2-，3-，4-氰基吡啶為 TCI公司產品；戊二酸、消旋巴氯芬為Alfa公司產品；(R)-巴氯芬為 TRC公司產品；其他試劑為國產分析純；HPLC所用流動相為色譜純。

1.2 催化轉化反應

離心收集發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體，采用50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 7.2) 洗滌菌體3次，115 ℃烘干測菌體干重，按30 mg/mL的菌體干重將菌體重懸至5 mL體系，添加3-(4-氯苯基)-戊二腈0.04 g(終濃度 20 mmol/L)，催化反應在 30 ℃、200 r/min條件下進行。

1.3 酶活檢測

酶活采用國際單位，描述為：30 ℃下每分鐘生成1 μmol氨所需酶量為一個酶活單位 (U)；比酶活用每克干菌體 (DCW) 所產生的酶活表示(U/g)。腈水解酶菌株按方法1.2所示進行轉化反應，酶活采用苯酚-次氯酸鈉法測定反應中生成的氨來快速檢測[22]。

1.4 高產菌株的篩選及鑒定

本實驗所采用的菌種由江南大學制藥工程實驗室保藏，將甘油管菌種接到種子培養(yǎng)基中進行活化，再按1%接種量轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，按1.2中方法進行催化反應，并按1.3中方法測定氨濃度并計算出酶活。

對實驗室保存的所有腈水解酶菌株進行篩選，得到對底物3-(4-氯苯基)-戊二腈有活性的菌株 21株，轉化率 50%以上有 2株 (XY32和CN7)，但是其產物均為3-(4-氯苯基)-戊二酸，不具有選擇性；轉化率在 20%以上的菌株有 7株(CA4-3、CN7、CA4-1、XY32、CN4、CN5、WX12)。最終選擇產物為3-(4-氯苯基)-4-氰基丁酸、轉化率為34%的WX12為出發(fā)菌株進行后續(xù)實驗。

WX12在察氏培養(yǎng)基固體平板上30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，并進行形態(tài)學初步觀察。分子生物學鑒定采用 ITS-5.8S rDNA序列分析方法[23]。菌體與石英砂混合后液氮研磨，根據Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取。以 ITS1 (5￠-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3￠)和ITS4 (5￠-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3￠) 為引物[23]，對菌株的ITS-5.8S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用TIANGEN試劑盒回收，與載體pMD18-T連接，轉化于大腸桿菌E. coliDH5α感受態(tài)細胞中，經藍白斑篩選并驗證載體已成功連接到目的片段后由北京天一輝遠生物科技有限公司完成測序。將所測得的序列與 GenBank數(shù)據庫中的已有序列進行Blast比對分析。系統(tǒng)進化分析由分子進化遺傳分析軟件MEGA version 3.1完成。

1.5 巴氯芬的合成

以4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸為底物，經兩步化學反應可合成巴氯芬[20]：第一步，氰基氨化，不完全水解生成酰胺；第二步，霍夫曼降解反應，酰胺變成氨基 (圖1)。

圖1 4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸合成巴氯芬過程[20]Fig. 1 Synthesis of baclofen from 4-cyano-3-(4-chlorophenyl)-acid[20].

在第一步的腈基氨化反應中，每200 mg單腈單酸產物，加入3 mL的NaOH (2.5 mol/L) 和6 mL H2O2，反應過程中以TLC進行實時監(jiān)測，直至無單腈單酸殘余。終止反應，邊攪拌邊加入濃HCl進行中和，可發(fā)現(xiàn)有白色小顆粒狀固體析出，至固體析出不再增多為止，冰浴1 h，抽濾，旋干，可得到白色粉末狀產物單酰胺單酸156 mg(產率 72.3%)。

第二步反應中，單酰胺單酸先用2.5 mol的1 mol/L的NaOH溶解，另外2.5 mol的1 mol/L的NaOH與1.2 mol的Br2(38.8 μL) 冰浴下混合，冰浴下緩慢加入到單酰胺單酸溶解液中，冰浴中反應30 min，常溫反應30 min，40 ℃反應 30 min，70 ℃反應約2 h (實驗過程中進行波層色譜層析(HPLC) 實時監(jiān)測，當?shù)孜锿耆暮蠼K止反應)。緩慢滴加濃鹽酸使中和至pH=6，離心，上清和沉淀分別進行TLC和HPLC檢測。

1.6 分析方法

1.6.1 產物4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸的檢測

轉化反應終止后用濃鹽酸將樣品調至酸性(pH 2)，再加入等體積甲基叔丁基醚，渦旋儀混勻后于12 000 r/min離心1 min。取上層有機相用薄層色譜層析 (TLC) 進行初步檢測。展開劑為二氯甲烷∶冰醋酸=50∶1，在254 nm的紫外燈下觀察。吹干展開劑，將層析板置于溴甲酚綠乙醇溶液中數(shù)秒后，使其受熱至有樣品顯色 (底物無顏色；產物顯黃色)。有產物點出現(xiàn)的樣品取2 mL有機相，充分揮發(fā)，等體積HPLC流動相(正己烷∶異丙醇=1∶9) 溶解，HPLC定量檢測，檢測條件為：大賽璐鍵合型手性柱CHIRALPAK?IB (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，含 0.05%冰醋酸的異丙醇/正己烷=9/1為流動相，流速0.4 mL/min，波長為230 nm處檢測。

以經核磁鑒定的產物和底物 3-(4-氯苯基)-戊二腈為標樣，測定此條件下物質的摩爾量與峰面積之間的關系，分別滿足線性關系y1(底物)=6014A1+31.92 (R2=0.999) 與y2(產物)=2359A2?339.0 (R2=0.999)。故

1.6.2 巴氯芬的檢測

采用薄層層析法 (TLC) 定性檢測，通過茚三酮顯色；手性HPLC檢測[24]條件為：Daicel手性色譜柱CROWNPAK?CR(+)/(-) (4.0 mm×150 mm，5 μm)，含10%甲醇、pH 1.5的高氯酸水溶液為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長為200 nm，柱溫 40 ℃。(R)-巴氯芬和(S)-巴氯芬的保留時間分別為tS=17.3 min，tR=27.1 min，故 (S)-巴氯芬(即產物(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸) 的對映體過量值為：

式中，AS：液相色譜分析 (S)-巴氯芬的峰面積。AR：液相色譜分析 (R)-巴氯芬的峰面積。

2 結果

2.1 高產菌株鑒定

通過篩選獲得了一株編號為WX12的菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中成菌球狀，平板觀察為白色絲狀，顯微觀測形態(tài)如圖2所示，分子生物學鑒定結果為赤霉菌G. intermediaWX12，對該菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析結果見圖3。

圖2 赤霉菌WX12的顯微鏡觀測圖Fig. 2 Microscope pictures of Gibberella intermedia WX12.

圖3 通過neighbor-joining法構建的基于菌株WX12的ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strain WX12 constructed by the neighbor-joining method.

2.2 發(fā)酵產酶曲線

種子液以1%的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，定時取樣，按方法1.2稱量菌體干重，靜息細胞催化轉化反應8 h后苯酚-次氯酸鈉法測定酶活。由圖4可知：發(fā)酵培養(yǎng)96 h，菌體干重和酶活均達到最大值，分別為 3.94 g/L和49.57 U/g。

2.3 催化特性研究

2.3.1 最適溫度和pH

按方法 1.2中的轉化體系，分別在不同 pH值的緩沖液和不同溫度轉化反應 24 h，得到WX12 的最佳轉化條件為：30 ℃ (圖 5A)，pH=8.0的磷酸鈉緩沖液 (圖5B)。

圖4 WX12發(fā)酵產酶曲線Fig. 4 Time course of enzyme production for WX12.

圖5 溫度和pH對轉化過程的影響Fig. 5 Effect of temperature (A) and pH (B) on the reaction. (A) The reaction was carried out in sodium phosphate buffer (pH 7.2). (B) The reaction was carried out at 30 °C and different pH (pH=6.0?9.0: Sodium phosphate buffer solution; pH=9.0?10.0: Na2CO3/NaHCO3 buffer).

2.3.2 轉化實驗進程

按上述轉化體系在最適溫度和pH值條件下進行催化轉化反應，測定反應進程，結果如圖6所示?？芍恨D化時間為24 h時產率達最大值90%。

2.3.3 底物特異性

圖6 腈水解酶的催化轉化進程Fig. 6 Catalytic conversion process of WX12 nitrilase.

分別以不同的芳香腈、脂肪腈和雜環(huán)腈為底物，測定WX12的催化活性，結果如表1所示。結果表明，WX12腈水解酶對脂肪腈類和雜環(huán)腈類具有較高的酶活，其中對丁二腈具有最高活性。而對芳香腈類物質如苯甲腈也具有一定的水解效果，但當氰基附近帶有較大的取代基團時，由于受到立體阻遏效應的影響，酶活性則顯著減小，如2-苯基丁腈、扁桃腈、芐烯丙二腈等不能被水解。

2.4 水解產物立體構型的確定

WX12催化3-(4-氯苯基)-戊二腈水解得到的產物 4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸沒有光學純的標準品，不能直接檢測水解產物的構型，但因后續(xù)化學合成反應不改變產物的構型，故可通過合成最終產物巴氯芬來進行檢測。

WX12生物轉化后的產物按1.5中方法進行終產物巴氯芬的合成，按1.6.2中方法進行HPLC檢測 (圖7)，可知，生成的終產物為 (S)-巴氯芬，且ee＞99%。

表1 菌株對各種腈類化合物的酶活性Table 1 Nitrilase activity towards various aliphatic, aromatic and heterocyclic nitriles

圖7 WX12催化反應產物巴氯芬的HPLC譜圖Fig. 7 The HPLC spectrum of product catalyzed by WX12. Green for the standard sample of racemic baclofen. Red for the standard sample of (R)-baclofen. Blue for the product catalyzed by WX12.

3 討論

化學-酶共催化有機合成法可以克服化學法與酶法單一催化有機合成反應時存在的缺點，是有機合成反應的新途徑[21]，然而利用化學-酶共催化法來催化潛手性的 3-(4-氯苯基)-戊二腈轉化成為合成巴氯芬關鍵中間體 4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸的研究卻鮮有報道。

本研究篩選得到腈水解酶菌株G. intermediaWX 12，最優(yōu)催化轉化條件為：30 ℃，50 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 8.0)，轉化24 h，經HPLC檢測產率達90.2%。產物4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸經氰基不完全水解和霍夫曼重排反應后所得的巴氯芬，HPLC鑒定為絕對構型的 (S)-巴氯芬，ee＞99%。據文獻[17,20]報道，ee值為 77%的(S)-3-(4-氯苯基)-4-氰基丁酸，經霍夫曼重排(Hoffman rearrangement) 可得到ee值為86%的(S)-巴氯芬；經庫爾提斯重排 (Curtius rearrangement) 則可得到ee值為 85%的 (R)-巴氯芬。因此，(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸是合成光學純巴氯芬的重要前體，不但可以經腈基水解至酰胺再通過霍夫曼重排可得到S構型的巴氯芬，還可在羧基衍生后經庫爾提斯重排得到氨基，繼而將剩余的氰基水解得到R構型的巴氯芬。

具有腈基水解酶活性的菌株G. intermediaWX 12可高效、高區(qū)域選擇性、高立體選擇性水解對稱二腈化合物，得到光學純的單腈單酸中間體；而后續(xù)可通過不同的化學轉化可以合成光學純的 (R)或(S)-γ-氨基酸[20]，為光學純的γ-氨基酸的合成研究打下了基礎。

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September 3, 2012; Accepted: December 3, 2012

Zhenghong Xu. Tel/Fax: +86-510-85918206; E-mail: Zhenghxu@jiangnan.edu.cn Dunming Zhu. Tel: +86-22-84861962; Fax: +86-22-84861996; E-mail: zhu_dm@tib.cas.cn

國家重點基礎發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB710801)，天津科技計劃項目 (No. 09ZCKFSH01000) 資助。

Biocatalytic desymmetric hydrolysis of 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile to the key precursor of optically pure baclofen

Meizhen Xu1, Jie Ren2, Jingsong Gong1, Wenyue Dong2, Qiaqing Wu2, Zhenghong Xu1,and Dunming Zhu2

1Laboratory of Pharmaceutical Engineering,School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China
2National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes,Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin300308,China

We produced (S)-4-cyano-3-(4-chlorophenyl)-butyrate by highly stereoselective biocatalyst in this study. A nitrilase-producing strain, namedGibberella intermediaWX12, was isolated by 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile as substrate in the screening with phenol-sodium hypochlorite method. The fermentation conditions and catalytic properties of this strain were investigated. The preferred carbon and nitrogen sources for nitrilase production were lactose (30 g/L) and peptone (20 g/L). After being cultivated for 96 h, the cells were collected for use in biotransformation. The hydrolysis of 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile was performed at 30 °C in phosphate buffer (pH 8.0, 50 mmol/L) for 24 h to give(S)-4-cyano-3-(4-chlorophenyl)-butyric acid with 90% yield and >99% ofee, which can be used for the synthesis of (R)-and (S)-baclofen. The configuration of product was determined by chemically converting it to baclofen and comparison with the authentic sample by chiral HPLC analysis.

nitrilase, 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile, 4-cyano-3-(4-chlorophenyl)-butyric acid, baclofen

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710801), Tianjin Municipal Science & Technology Project (No. 09ZCKFSH01000).

(本文責編 郝麗芳)