蔣金來(lái)，王令充，吳 皓，劉 睿，劉小莉，朱蘊(yùn)菡，劉 新

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)一級(jí)學(xué)科，江蘇南京 210046）

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）為軟體動(dòng)物門（Mollusca），瓣 鰓 綱（Lamellibranchia），蛤 蜊 科（Mactridae）的動(dòng)物[1]，廣泛分布于我國(guó)南北各海區(qū)，生活于沿海的潮間帶，別名蛤剌、沙蛤、沙蜊，白蜆子等，其貝殼和軟體均可入藥，軟體部含有豐富的蛋白質(zhì)和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分，且肉味咸寒，具有潤(rùn)五臟、止消渴等功效[2]，是具有研究開發(fā)潛力的藥用海洋生物。隨著近代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和人們對(duì)海洋湖沼資源認(rèn)識(shí)的提升，對(duì)海洋湖沼生物資源的研究開發(fā)不斷深入，已成為新產(chǎn)品研發(fā)的熱點(diǎn)之一[3]。對(duì)四角蛤蜊進(jìn)行藥學(xué)研究和產(chǎn)品開發(fā)可以將低值海洋生物資源進(jìn)行高值利用，具有重要的意義。近年來(lái)利用蛋白酶水解蛋白的研究日益劇增，對(duì)四角蛤蜊蛋白水解的研究亦逐步增加。目前對(duì)四角蛤蜊的酶解僅局限于單酶水解法[4]，采用的單酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶[5-6]，而對(duì)其雙酶復(fù)合水解[7]的研究尚未報(bào)道，蛋白質(zhì)的水解不僅需要內(nèi)切酶，而且需要外切酶的參與，內(nèi)切酶只能將蛋白質(zhì)水解為多肽及少量的氨基酸，外切酶是從肽鏈的N端或C端將多肽水解為氨基酸，所以在水解蛋白質(zhì)時(shí)，要有內(nèi)切酶和外切酶的雙酶共同作用才能得到高氨基酸含量的復(fù)合氨基酸液。本實(shí)驗(yàn)采取內(nèi)-外兩步酶解法水解四角蛤蜊，以期為海洋蛋白高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四角蛤蜊 采自江蘇省南通茅家港，經(jīng)清水吐沙后取鮮肉棄殼備用；胰蛋白酶活力5萬(wàn)U/g，Amresco公司；胃蛋白酶（3000U/g）、木瓜蛋白酶（80萬(wàn)U/g）、菠蘿蛋白酶（30萬(wàn)U/g）、中性蛋白酶（5萬(wàn)U/g）、酸性蛋白酶（5萬(wàn)U/g）、堿性蛋白酶（20萬(wàn)U/g）、風(fēng)味蛋白酶（2萬(wàn)U/g）、復(fù)合蛋白酶（12萬(wàn)U/g）南京奧多福尼生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑 均為分析純。

BP 211D型電子天平 德國(guó)Sartorious公司；RotavaporR－210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)BUCHI公司；pHs－3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JJ－2型組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇省金壇市榮光儀器制造公司；Avanti J－25高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Backman公司；SHZ－III型循環(huán)水式真空泵 南京科爾儀器設(shè)備有限公司；Unique－s15型超純水儀 廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；DF－101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解液制備方法 將四角蛤蜊軟體洗凈泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次0.5h，瀝干，稱重，加3倍量水勻漿，再加入酶進(jìn)行酶解，結(jié)束后于95～100℃水浴滅活10min，然后于6000r/min離心15min得上清液為酶解液。

1.2.2 測(cè)試指標(biāo)與測(cè)定方法 氨基態(tài)氮含量用甲醛滴定法[8]測(cè)定；總氮回收率（%）=酶解液中氮含量/原料中總氮含量×100，酶解液和原料中總氮含量用凱氏定氮法[9]測(cè)定。

1.2.3 最佳內(nèi)切酶的選取 在加酶量、固液比和酶解時(shí)間一定的前提下，用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶7種酶酶解四角蛤蜊，以酶解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選出水解效果最好的內(nèi)切酶。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 不同內(nèi)切酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different incision enzymes

1.2.4 內(nèi)切酶條件優(yōu)化 以1.2.3選取的酶解效果最好的酶為目標(biāo)內(nèi)切酶，以氨基酸態(tài)氮含量和總氮回收率作為指標(biāo)，選擇酶用量、pH、溫度、時(shí)間等因素做單因素實(shí)驗(yàn)，然后每個(gè)因素確定3個(gè)水平，按L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化內(nèi)切酶解條件，正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 外切酶的篩選 在內(nèi)切酶解液的基礎(chǔ)上做外切酶解實(shí)驗(yàn)，當(dāng)加酶量、固液比和酶解時(shí)間固定時(shí)，用風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解內(nèi)切酶解液，以最后酶解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率水平評(píng)價(jià)效果最佳外切酶。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

表3 不同外切酶的酶解條件Table 3 Hydrolysis conditions of different excision enzymes

1.2.6 外切酶條件的優(yōu)化 以1.2.5篩選的最佳酶解效果的酶為外切酶，以氨基酸態(tài)氮含量和總氮回收率作為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶用量、pH、溫度、時(shí)間四因素并每個(gè)因素選取3個(gè)水平，按L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化外切酶解條件。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)切酶的選擇

從表5中可以看出，7種內(nèi)切酶中，中性蛋白酶的酶解效果最好，胰蛋白酶和堿性蛋白酶次之，其他四種酶的酶解效果較差，由此確定中性蛋白酶為目標(biāo)內(nèi)切酶。

表5 不同內(nèi)切酶的酶解效果比較Table 5 Effect of incision enzymes on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.2 內(nèi)切酶單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶用量對(duì)酶解效果的影響 結(jié)果見圖1，如圖1示，當(dāng)?shù)孜锪恳欢〞r(shí)，隨著酶用量的增加，酶解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率迅速增加，當(dāng)酶用量大于1500U/g肉時(shí)，酶解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率增加量逐漸降低，且變化量很小，說(shuō)明對(duì)水解效果的影響已開始減弱，這是因?yàn)殡S著水解產(chǎn)物的增加，酶活力開始受到抑制，同時(shí)，考慮到成本因素，酶用量應(yīng)以1500U/g為宜。

圖1 酶用量對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Effect on enzyme dosage on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.2.2 溫度對(duì)酶解效果的影響 溫度影響蛋白酶催化反應(yīng)速度及其穩(wěn)定性，從而影響酶解反應(yīng)的效率。為此，設(shè)定固液比1∶3，酶用量為1500U/g肉，初始pH為7.0，分別在40、45、50、55、60℃條件下酶解，4h后測(cè)定水解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effect of temperature on the hydrolysis of Mactra veneriformis

如圖2所示，隨著溫度的升高氨基酸態(tài)氮含量和總氮回收率不斷增加，50℃時(shí)均達(dá)到最大值，繼續(xù)升溫，氨基態(tài)氮含量和總氮回收率反而降低。這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，引起了酶分子結(jié)構(gòu)次級(jí)鍵解體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使得酶活力減弱[10]。因此，酶解的適宜溫度為50℃。

2.2.3 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 時(shí)間影響蛋白酶酶解程度及其酶活力，從而影響酶解反應(yīng)的效果。為此，設(shè)定固液比1∶3，酶用量為1500U/g肉，初始pH為7.0，于50℃下分別酶解2、4、6、8、10h，然后測(cè)定水解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率，結(jié)果見圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Effect of time on the hydrolysis of Mactra veneriformis

從圖3中可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率逐漸增加，當(dāng)酶解6h后，酶解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率增加量變少，說(shuō)明酶活力開始減弱，因此應(yīng)酶解6h為宜。

2.2.4 pH對(duì)酶解效果的影響 設(shè)定固液比1∶3，酶用量為1500U/g肉，溫度50℃，分別在初始pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0條件下酶解，6h后測(cè)定水解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率，結(jié)果見圖4。

圖4 pH對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis of Mactra veneriformis

圖4結(jié)果表明，由于目標(biāo)內(nèi)切酶是中性蛋白酶，因此在中性條件下，對(duì)四角蛤蜊的酶解效果最好。當(dāng)pH為7.0時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和總氮回收率最高，故酶解的適宜初始pH為7.0。

2.2.5 固液比對(duì)酶解效果的影響 分別設(shè)定固液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，加酶量為1500U/g肉，溫度50℃，在初始pH7.0條件下酶解6h，滅酶后測(cè)定酶解液中氨基態(tài)氮含量和總氮回收率，結(jié)果見圖5。

圖5 固液比對(duì)酶解效果的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on the hydrolysis of Mactra veneriformis

由圖5可以看出，隨著固液比的增加，氨基酸態(tài)氮含量和總氮回收率有一個(gè)先升后降的漸變趨勢(shì)，這是因?yàn)楣桃罕冗^(guò)大，會(huì)使酶解產(chǎn)物增量太快，反過(guò)來(lái)抑制酶解反應(yīng)，并且固液比對(duì)酶解效果的影響不是很明顯。故實(shí)驗(yàn)最終將固液比定為1∶3（g/mL）。

2.3 內(nèi)切酶解條件優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考慮到以上各因素對(duì)酶解效果的綜合影響，選擇酶用量、pH、溫度、時(shí)間四因素三水平L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定中性蛋白酶最佳酶解條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6和表7。

由表6中R值及表7中方差分析可知，綜合氨基態(tài)氮含量、總氮回收率兩個(gè)指標(biāo)，影響內(nèi)切酶解效果的主次因素為加酶量＞溫度＞時(shí)間＞pH，其最優(yōu)條件是A2B1C2D3，進(jìn)一步顯著性檢驗(yàn)表明，加酶量對(duì)酶解效果具有顯著性影響（p＜0.05）。因此根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，四角蛤蜊肉內(nèi)切酶解最適宜條件為加中性蛋白酶1500U/g肉，調(diào)初始pH7.5，于45℃下酶解6h。

表6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 The results of orthogonal experiment

表7 內(nèi)切酶水解氨基氮含量方差分析Table 7 Incision enzymes hydrolysis amino nitrogen content of variance analysis

2.4 外切酶解的篩選

在內(nèi)切酶解液基礎(chǔ)上進(jìn)行下一步酶解以篩選最佳外切酶，從表8可以看出，風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶比較，后者的氨基氮含量和總氮回收率均明顯高于前者，因此確定復(fù)合蛋白酶為外切酶。

表8 不同外切酶的酶解效果比較Table 8 Effect of excision enzymes on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.5 外切酶解條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-13]及單因素實(shí)驗(yàn)，在中性蛋白酶酶解液基礎(chǔ)上選擇溫度、pH、加酶量、時(shí)間四因素三水平按L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化外切酶解條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9和表10。

由表9中R值及表10中方差分析可知，各因素對(duì)外切酶解效果的影響程度為pH＞加酶量＞時(shí)間＞溫度，其最優(yōu)條件是A1B3C3D3，其中pH為外切酶解效果顯著性影響因素（p＜0.05）。因此根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，外切酶解最適宜條件為加復(fù)合蛋白酶4200U/g肉，調(diào)初始pH7.0，于45℃下酶解11h。在此內(nèi)-外兩步酶解條件下，四角蛤蜊肉酶解產(chǎn)生氨基態(tài)氮含量為20.78mg/g，其總氮回收率為88.19%。

表9 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 9 The results of orthogonal experiment

表10 外切酶水解氨基氮含量方差分析Table 10 Excision enzymes hydrolysis amino nitrogen content of variance analysis

3 結(jié)論

以四角蛤蜊為原料，用氨基酸態(tài)氮含量和總氮回收率為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)確定四角蛤蜊內(nèi)-外兩步酶解的酶種，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了內(nèi)-外兩步酶解的最佳條件為：先添加中性蛋白酶1500U/g肉，酶解溫度45℃，固液比1∶3（V/W），初始pH7.5，水解6h，滅活后改變條件，溫度45℃，初始pH7.0，固液比1∶3（V/W），添加復(fù)合蛋白酶4200U/g肉，在此條件下酶解11h。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶內(nèi)-外兩步酶解具有較好的水解效果，可酶解產(chǎn)生氨基氮含量為20.78mg/g，其總氮回收率為88.19%。

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