蔣增良，毛建衛(wèi)，4，*，黃 俊，吳元峰，蔡成崗，樊 誦2，

（1.浙江理工大學(xué)理學(xué)院，浙江杭州310018；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江杭州310023；4.浙江科技學(xué)院，中德農(nóng)產(chǎn)品加工工業(yè)研究院，浙江杭州 310023）

微生物酵素指以一種或多種新鮮蔬菜、水果等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而產(chǎn)生的，含有豐富的維生素、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，它具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強機體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能[1]。人類的多種疾病如衰老、動脈硬化、炎癥性疾病、糖尿病、癌癥等，被證實與活性氧和自由基有關(guān)[2－4]。Kris－Etherton等研究表明富含抗氧化成分的食品在防治自由基引起的疾病方面有重要的作用[5]。目前對氧化性能的研究還較少，微生物酵素呈現(xiàn)出來的抗氧化性能部分可能來自發(fā)酵過程，但機理尚不清楚。所以，闡明發(fā)酵過程中微生物酵素抗氧化性能的變化規(guī)律是很有必要的。本文以藍莓為原料，研究天然發(fā)酵過程中還原力、DPPH自由基、羥基自由基、超氧自由基和ABTS自由基清除能力的變化，以及與總酚含量的相關(guān)性，以期為進一步闡明微生物酵素產(chǎn)品的保健功能機理和綜合性開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓 采自浙江省紹興市的有機水果基地；紅糖 一級品，市購；α，α－二苯基－β－苦苯肼（DPPH）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、硝基四氮咪唑藍（NBT）、2，2－聯(lián)氮基－雙－（3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸）二氨鹽（ABTS）Sigma Chemical Co.（圣路易斯，美國）；其他所用到的化學(xué)試劑 分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司（上海，中國）。

TGL－16M高速立式冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；可見光－紫外分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司；HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；Sartorius普及型pH計（PB－10）上海安因科技有限公司；SW－CJ－1F型單人雙面凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓酵素的制備 用無菌水在無菌條件下輕輕地沖洗藍莓以除去表面沙子和灰塵等，在無菌操作臺中自然晾干。紅糖用紫外殺菌45min。藍莓與紅糖按質(zhì)量比1∶1，加入到已滅菌的玻璃瓶中，封口，放在暗處，常溫下發(fā)酵56d。為了避免潛在的菌體污染，制備過程中所有操作都在無菌條件下進行。在發(fā)酵過程中，每隔8d取樣，樣品經(jīng)高速離心機10000r/min離心10min后，用于測定。

1.2.2 總酚含量測定[6]100μL樣品加入到45.9mL去離子水，再加入1mL Folin－Ciocalteau試劑，反應(yīng)3min，最后加入3mL 20%的碳酸鈉溶液，25℃恒溫水浴振蕩2h，在760nm下測定吸光度，以去離子水為參比溶液?？偡雍恳詻]食子酸等價物表示，按照標準曲線線性方程y=0.0917x+0.0208，R2=0.9996來測定總酚含量。其中：y為吸光度，x為樣品濃度（GAE，μg）。

1.2.3 DPPH自由基清除能力[7]40μL樣品加入到4mL 0.1mmol/L DPPH－甲醇溶液中，再加入450μL 50mmol/L Tris－HCl buffer（7.4），25℃下恒溫水浴30min。以去離子水為參比溶液。在517nm下測定吸光度。

DPPH自由基清除能力（%）=[（A0－（A1－A2））/A0]×100 式（1）

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品測定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度。

1.2.4 還原力測定[8]30μL樣品加入到2.5mL磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH6.6），然后加入2.5mL 1%鐵氰化鉀（w/v），50℃，反應(yīng)30min，再加入10%三氯乙酸（w/v）2.5mL，在3000r/min下離心10min，立即取2.5mL上清液，加入2.5mL去離子水和0.5mL 0.1%三氯化鐵（w/v）。以去離子水為參比溶液。在700nm下測定。吸光度值越高，還原力越強。

1.2.5 超氧自由基清除能力[9]50μL樣品加入到950μL磷酸緩沖液（0.1mol/L pH7.4），然后加入1mL 120μmol/L PMS（用磷酸緩沖液配制），1mL 936μmol/L NADH（用磷酸緩沖液配制）和1mL 300μmol/L NBT（用磷酸緩沖液配制）。在環(huán)境溫度下，反應(yīng)5min。以去離子水為參比溶液。在560nm下測定吸光度。超氧自由基清除能力計算按照式（1）。

1.2.6 羥基自由基清除能力[10]135μL樣品加入到1.4mL 6mmol/L H2O2，然后加入0.6mL 20mmol/L水楊酸鈉和2mL 1.5mmol/L硫酸亞鐵，37℃下恒溫水浴1h。以去離子水為參比溶液。在562nm下測定吸光度。羥基自由基清除能力計算按照式（1）。

1.2.7 ABTS自由基清除能力[11]用7mmol/L ABTS（用5mmol/L的PBS，pH7.4配制），加入過硫酸鉀最終濃度為2.45mmol/L，在室溫下黑暗放置12h～16h。使用前把ABTS自由基用PBS稀釋成在734nm下吸光度為0.7±0.02。

取10μL樣品加入到5mL上述稀釋液中，在30℃下，反應(yīng)5min。以去離子水為參比溶液。在734nm下測定吸光度。ABTS自由基清除能力計算按照式（1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓酵素發(fā)酵過程中pH的變化

發(fā)酵過程中藍莓酵素pH隨發(fā)酵時間的變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵過程中pH變化Fig.1 Changes in pH value during fermentation

由圖1可知，藍莓酵素的pH在前8d內(nèi)快速從5.71下降到4.48，之后趨于緩和，只有小幅度的間歇性上升和下降，說明藍莓酵素初期發(fā)酵快速，8d后進入慢發(fā)酵階段。pH的下降是由于在發(fā)酵過程中發(fā)酵液中有機酸的濃度增加導(dǎo)致[12]。pH間歇地升高可能是由于微生物對蛋白質(zhì)的水解和對氨基酸的利用導(dǎo)致[13]。

2.2 藍莓酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

本研究采用Folin－Ciocalteau法測定總酚含量，這是一個在恒溫下伴隨有磷鎢酸和磷鉬酸參與的復(fù)雜的還原反應(yīng)，吸光度越高，總酚含量越高。發(fā)酵過程中藍莓酵素總酚含量變化結(jié)果，如圖2所示。

圖2 發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.2 Changes in total phenolic compounds during fermentation

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，藍莓酵素發(fā)酵液中總酚含量呈逐漸上升趨勢，發(fā)酵56d總酚由發(fā)酵前的1.850mg/mL增加到2.308mg/mL。發(fā)酵前16d增幅明顯，發(fā)酵56d后比未發(fā)酵時增加了24.7%。Chu Sheng-che等[14]的研究表明總酚含量的增加與微生物把復(fù)雜的大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類物質(zhì)有關(guān)，說明發(fā)酵后抗氧化成分含量增加了。

2.3 藍莓酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

DPPH自由基是一個以氮為中心的脂溶性的自由基，相對于其他方法，被廣泛的運用于評價短時間內(nèi)的抗氧化活性。DPPH自由基比羥基自由基和超氧自由基更穩(wěn)定，這使得它更有利于運用于抗氧化性的評價[15]。藍莓酵素在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.3 Changes in DPPH scavenging ability during fermentation

由圖3可知，藍莓酵素DPPH自由基清除能力在發(fā)酵過程上升了3.6%，第48d的時候達到最高，清除率為94.41%。Fessenden等[16]研究認為酚類物質(zhì)能很容易的給出一個氫離子并通過共振雜化而穩(wěn)定，是具有高自由基清除能力的主要原因。

2.4 藍莓酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

藍莓酵素在發(fā)酵過程中還原力的變化，如圖4所示。藍莓酵素的還原力在前8d內(nèi)迅速從0.450上升到0.538，之后間歇性的小幅度變化，總體呈上升趨勢。說明藍莓酵素在發(fā)酵過程中抗氧化成分增加，發(fā)酵前后還原力提高了20.4%。

2.5 藍莓酵素發(fā)酵過程中超氧自由基清除能力的變化

圖4 發(fā)酵過程中還原力變化Fig.4 Changes in reducing power during fermentation

超氧陰離子自由基在活性氧的形成中發(fā)揮重要作用，如過氧化氫、羥自由基和單線態(tài)氧，這些物質(zhì)都可以誘導(dǎo)脂類、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷[17]。本實驗采用PMS/NADH—NBT體系測定超氧自由基清除能力。溶解氧通過PMS/NADH偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生超氧自由基，導(dǎo)致NBT減少，從而使吸光度增加，加入抗氧化劑后吸光度下降暗示著超氧自由基的消耗。藍莓酵素在發(fā)酵過程中超氧自由基清除能力的變化如圖5所示。

圖5 發(fā)酵過程中超氧自由基清除能力的變化Fig.5 Changes in superoxide radical scavenging ability during fermentation

由圖5可知，在56d發(fā)酵過程中，藍莓酵素對超氧自由基的清除能力呈增長趨勢，發(fā)酵前后增加了5.7%。第48d達到最大，清除率為56.66%。據(jù)報道，超氧自由基活性可能歸咎于酚類物質(zhì)自由的羥基的作用。此外，黃酮化合物分子的A環(huán)或B環(huán)上有多羥基取代和有自由的3-羥基取代基都可以呈現(xiàn)出超氧自由基清除能力[18]。

2.6 藍莓酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力的變化

羥基自由基是生物體系產(chǎn)生的一種極具反應(yīng)性的自由基，被認為在自由基病理學(xué)上具有高度損傷性，它的損傷能力幾乎在每一個活細胞內(nèi)都能發(fā)現(xiàn)[19]。本研究采用硫酸亞鐵-過氧化氫體系產(chǎn)生羥基自由基，它是通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，利用水楊酸鈉對羥基自由基的捕捉而產(chǎn)生一種很方便的檢測方法。藍莓酵素在發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力的變化，如圖6所示。

由圖6可知，相對于其他自由基的清除能力，藍莓酵素對羥基自由基的清除能力相對較低。藍莓酵素對羥基自由基的清除能力在前8d內(nèi)快速上升，在接下來的16d內(nèi)急劇下降，第24d后又逐漸上升。第56d羥基自由基清除率為42.08%，與未發(fā)酵前相比增加了2.4%。

圖6 發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力的變化Fig.6 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation

2.7 藍莓酵素發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力的變化

藍莓酵素在發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力的變化，如圖7所示。

圖7 發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力的變化Fig.7 Changes in ABTS radical scavenging ability during fermentation

由圖7可知，在發(fā)酵過程中，藍莓酵素對ABTS自由基清除能力一直都在增加。在56d時，對ABTS自由基清除能力達到82.22%，與未發(fā)酵前相比增加了16.5%。Erel等[20]的研究表明高濃度的酚類物質(zhì)具有更高的清除ABTS自由基的能力，它們的作用取決于分子量、芳香環(huán)的數(shù)量和羥基取代基的性質(zhì)[21]。

2.8 藍莓酵素發(fā)酵過程中抗氧化性能與總酚含量的相關(guān)性分析

藍莓酵素在發(fā)酵過程中抗氧化性能與總酚含量的相關(guān)性分析，如表1所示。

表1 抗氧化性能與總酚含量的相關(guān)性Table 1 Correlation of antioxidant ability and total phenolic compounds

由表1可知，藍莓酵素在發(fā)酵過程中還原力與總酚含量相關(guān)性不高，相關(guān)系數(shù)r=0.515，p＞0.01；羥基自由基清除能力與總酚含量的相關(guān)系數(shù)r=0.184，p＞0.01不具相關(guān)性；DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力與總酚含量均具有顯著的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.952，0.860，0.975，p＜0.01。

3 結(jié)論

本研究表明以藍莓為原料，經(jīng)藍莓固有的多種有益菌天然發(fā)酵而產(chǎn)生的藍莓酵素產(chǎn)品具有優(yōu)良的抗氧化性能?？寡趸阅茏兓?guī)律研究表明：發(fā)酵過程中總酚含量、DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力總體呈逐漸增加趨勢，還原力和羥基自由基清除能力呈現(xiàn)先增加后略微降低再增加的趨勢；DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力與總酚含量均具有顯著的正相關(guān)性；還原力與總酚含量相關(guān)性不高；羥基自由基清除能力與總酚含量不具相關(guān)性，且相對于其他自由基清除能力，清除率相對較低。本研究為進一步闡明微生物酵素的保健功能機理和綜合性開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

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