陳曉鵬，楊來(lái)志，葛國(guó)朝，崔巍，屠佳，田野

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院肝膽一科，安徽蕪湖 241001)

乙酰肝素酶(也稱類肝素酶，heparanase，HPSE)是一種糖苷內(nèi)切酶，它通過降解細(xì)胞外基質(zhì)硫酸乙酰肝素蛋白多糖，在腫瘤轉(zhuǎn)移及血管生成等病理過中發(fā)揮重要作用，并在多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)［1-2］。故深入研究HPSE基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，對(duì)于合理調(diào)節(jié)其表達(dá)水平、探討腫瘤生物治療的新方法具有重要意義［3］。我們前期在克隆HPSE啟動(dòng)子核心片段的基礎(chǔ)上分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子雖可驅(qū)動(dòng)下游基因在腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)，但活性較低［4-5］。本研究我們擬對(duì)HPSE基因啟動(dòng)子上、下游鄰近序列進(jìn)行分段擴(kuò)增，并分別分析其促轉(zhuǎn)錄活性，為進(jìn)一步篩選、鑒定其增強(qiáng)子序列奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞和儀器

DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、PFX、dNTP、PCR Buffers(Takara 公司);PCR純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒(北京道普公司);無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(北京天能生物技術(shù)有限公司);T4 DNA ligase、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SalⅠ、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞、pEGFP-N1質(zhì)粒和各種引物(上海生工生物公司合成);胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂(英國(guó)Oxoid公司);Lipofectamne 2000、DMEM培養(yǎng)基和RPIM-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)。人肝癌細(xì)胞BEL-7402、胃癌細(xì)胞SGC-7901(上海中科院細(xì)胞庫(kù))。PCR擴(kuò)增儀(BIORAD公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)，倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);熒光顯微鏡(Nikon公司);FC500MPL流式細(xì)胞儀(Backman公司)。

1.2 候選序列的確定

根據(jù)HPSE之DNA序列，設(shè)計(jì)選取10個(gè)片段作為增強(qiáng)子候選序列(enhx，x分別為1，2……10)，其中啟動(dòng)子上游6段，啟動(dòng)子下游4段，每個(gè)片段共1 200 bp，為避免相鄰片段之間將增強(qiáng)子序列截為兩個(gè)部分，在兩相鄰片段之間重疊200 bp。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

改造載體 PEGFP-N1中的 VspⅠ位點(diǎn)，增加KpnⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)，退火引物為taatGGCGCGCCaa tcgaaGGTACCgacaaACGCGTatccgaGTCGACat和taatGTC GACtcggatACGCGTttgtcGGTACCttcgattGGCGCGCCat，改造的質(zhì)粒命名為pEGFP-MU，作為本研究的陰性對(duì)照載體。化學(xué)方法合成猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)增強(qiáng)子序列，全長(zhǎng)237 bp。測(cè)序鑒定SV40增強(qiáng)子序列合成正確，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，并增加酶切位點(diǎn)(12 bp)，其中上游KpnⅠ酶切位點(diǎn)GGTACC，下游SalⅠ酶切位點(diǎn)GTCGAC，引物由上海生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系 50 μl，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 55 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min;將擴(kuò)增的片段插入到質(zhì)粒pEGFP-MU的KpnⅠ和SalⅠ兩酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建載體pEGFP-MU-SV40e;將連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽(yáng)性菌落、提取質(zhì)粒DNA，分別雙酶切和PCR擴(kuò)增、測(cè)序鑒定，正確者作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照載體。根據(jù)HPSE之DNA序列設(shè)計(jì)引物，從人血基因組中PCR擴(kuò)增上述候選增強(qiáng)子序列1～10，并增加上述酶切位點(diǎn)，上游Kpn I位點(diǎn)后面序列分別與候選增強(qiáng)子enhx序列5'端吻合，下游SalⅠ位點(diǎn)后面序列分別與enhx序列3'端互補(bǔ)，預(yù)計(jì)enh6擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為1 092 bp(包括完整的序列1 080 bp和酶切位點(diǎn)12 bp)，其余片段擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為1 212 bp(包括完整的候選增強(qiáng)子序列1 200 bp和酶切位點(diǎn)12 bp)。同法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)載體pEGFP-MU-enhx并鑒定。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和功能分析

人腫瘤細(xì)胞株BEL-7402、SGC-7901常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代、凍存和培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，待融合度達(dá)80%調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用6孔板鋪板，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000說明書操作。在37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞40 h。貼壁細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后，用含血清培養(yǎng)基終止消化。所有轉(zhuǎn)染條件相同，轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h，然后進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察和流式細(xì)胞分析，檢測(cè)熒光強(qiáng)度和轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

SV40增強(qiáng)子PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增條帶(長(zhǎng)度為249 bp，包括SV40增強(qiáng)子的完整序列和酶切位點(diǎn)12 bp)與預(yù)期的SV40增強(qiáng)子237 bp片段基本符合，條帶清晰。構(gòu)建的pEGFP-MU-SV40e載體行KpnⅠ和SalⅠ雙酶切電泳可見2個(gè)片段，單一酶切均僅有1個(gè)片段，初步證明載體構(gòu)建正確。以pEGFP-MU-SV40e重組質(zhì)粒為模板，可擴(kuò)增出長(zhǎng)為SV40增強(qiáng)子序列片段，測(cè)序結(jié)果包含完整的SV40增強(qiáng)子序列，與GenBank一致。對(duì)比一致是從33 bp處至269 bp處，長(zhǎng)度為237 bp。從 27～32 bp處為GGTACC是KpnⅠ酶切位點(diǎn)，從270～275 bp處為GTCGAC是SalⅠ酶切位點(diǎn)(圖1)。

圖1 SV40增強(qiáng)子PCR產(chǎn)物部分測(cè)序圖Fig 1 Partial sequencing graph of PCR product of SV40 enhancer

2.2 實(shí)驗(yàn)載體pEGFP-MU-enhx的構(gòu)建和鑒定

10個(gè)候選序列PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增條帶與預(yù)期長(zhǎng)度1 200 bp片段符合。構(gòu)建的pEGFP-MU-enhx載體行KpnⅠ和SalⅠ雙酶切電泳可見2個(gè)片段，單一酶切均僅有1個(gè)片段，初步證明載體構(gòu)建正確。以pEGFP-MU-enhx重組質(zhì)粒為模板，可擴(kuò)增出長(zhǎng)為1 200 bp左右的候選增強(qiáng)子序列片段，測(cè)序結(jié)果包含了完整的候選序列，與GenBank一致(圖2)。對(duì)比一致是從33 bp處至1 232 bp處，長(zhǎng)度為1 200 bp;27～32 bp處為GGTACC是KpnⅠ酶切位點(diǎn)，1 233～1 238 bp處為GTCGAC是SalⅠ酶切位點(diǎn)。

2.3 重組質(zhì)粒的真核表達(dá)與功能分析

陰性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-MU轉(zhuǎn)染BEL-7402和SGC-7901細(xì)胞后熒光強(qiáng)度較弱;陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pEGFP-MUSV40e、實(shí)驗(yàn)載體 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8轉(zhuǎn)染BEL-7402和SGC-7901細(xì)胞后熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，其余實(shí)驗(yàn)載體熒光強(qiáng)度與陰性對(duì)照相似(圖3、4)。流式細(xì)胞儀分析中以發(fā)光細(xì)胞百分比代表細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。質(zhì)粒pEGFP-MU在BEL-7402和SGC-7901細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率較低，質(zhì)粒pEGFPMU-SV40e、實(shí)驗(yàn)載體 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8轉(zhuǎn)染效率較高，其余實(shí)驗(yàn)載體轉(zhuǎn)染效率與陰性對(duì)照相似，效率較低(見表1)。

圖2 第7候選片段PCR產(chǎn)物部分測(cè)序圖Fig 2 Partial sequencing graph of of PCR product of the 7thcandidate DNA fragment

圖3 各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞熒光圖Fig 3 Fluorogram of various kinds of plasmids in BEL-7402 cell

表1 各種載體在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率比較%Tab 1 Comparison of transcription efficiency of various kinds of plasmids in tumor cells %

3 討 論

圖4 各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞熒光圖Fig 4 Fluorogram of various kinds of plasmids in SGC-7901 cell

增強(qiáng)子是基因內(nèi)的一種DNA特異序列，能夠增強(qiáng)DNA轉(zhuǎn)錄活性，可與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(TF)特異結(jié)合從而極大地增強(qiáng)啟動(dòng)子活性。其結(jié)構(gòu)與啟動(dòng)子相似，也由多個(gè)元件組成，通常為100～200 bp長(zhǎng)度，核心組件8～12 bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在［6］。每個(gè)基因至少包含一個(gè)增強(qiáng)子，既可以定位于基因的兩端，也可以定位在基因中間，甚至遠(yuǎn)離基因多達(dá)數(shù)千個(gè)核苷酸。但與基因編碼序列不同，增強(qiáng)子無(wú)法僅僅根據(jù)DNA序列加以識(shí)別，必須通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)。鑒定增強(qiáng)子的實(shí)驗(yàn)方法主要有DNA結(jié)構(gòu)分析、序列分析和基因刪除和替換等，軟件預(yù)測(cè)是鑒定增強(qiáng)子的另一種方法，但不同的軟件預(yù)測(cè)差異較大，而且結(jié)果仍需實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證［7］，尚難普遍應(yīng)用。

本研究在前期發(fā)現(xiàn)SV40增強(qiáng)子可增強(qiáng)HPSE啟動(dòng)子表達(dá)活性［8］的基礎(chǔ)上，參考其他文獻(xiàn)［9-10］，選用HPSE基因啟動(dòng)子上、下游的部分片段作為候選序列，將其分為10段，在其上、下游引物分別添加KpnⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其克隆插入到含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、并經(jīng)改造過的真核表達(dá)載體pEGFP-MU中，構(gòu)建重組載體pEGFP-MU-enhx。然后分別轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株BEL-7402、SGC-7901，通過免疫熒光觀察和流式細(xì)胞儀分析方法檢測(cè)增強(qiáng)子候選序列對(duì)CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，以初步鑒定出具有增強(qiáng)子活性的候選序列。

為準(zhǔn)確判斷候選序列活性，本研究以未插入其他序列的質(zhì)粒pEGFP-MU作為陰性對(duì)照。SV40增強(qiáng)子是最早發(fā)現(xiàn)也是迄今功能最強(qiáng)大的病毒增強(qiáng)子，其核心序列是由72 bp的堿基對(duì)重復(fù)序列構(gòu)成。研究［11］表明SV40增強(qiáng)子修飾的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子可以提高轉(zhuǎn)錄活性2～3倍，而且不影響其腫瘤特異性。我們前期研究［8］也證明，SV40增強(qiáng)子可以增強(qiáng)HPSE啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。本研究中我們采用PCR擴(kuò)增克隆出SV40增強(qiáng)子序列，并引入KpnⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，然后將其插入到改造的質(zhì)粒pEGFP-MU序列中CMV啟動(dòng)子上游KpnⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pEGFP-MU-SV40e，作為本研究陽(yáng)性對(duì)照載體。電泳和測(cè)序結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將上述3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞株BEL-7402、SGC-7901，通過免疫熒光觀察和流式細(xì)胞儀分析方法檢測(cè)各個(gè)片段對(duì)CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，以初步鑒定出具有增強(qiáng)子活性的候選序列。

在同等條件下，將質(zhì)粒pEGFP-MU、pEGFP-MUSV40e和pEGFP-MU-enhx分別轉(zhuǎn)染人腫瘤細(xì)胞BEL-7402和SGC-7901。48 h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFPMU-enh8e在人腫瘤細(xì)胞BEL-7402和SGC-7901中均表達(dá)較強(qiáng)的熒光，與陽(yáng)性對(duì)照pEGFP-MU-SV40e相似。其余質(zhì)粒比陽(yáng)性對(duì)照pEGFP-MU-SV40e低，與陰性對(duì)照pEGFP-MU較接近。流式細(xì)胞儀與熒光觀察結(jié)果一致。初步提示第6、7和8活性片段可以增強(qiáng)CMV啟動(dòng)子(驅(qū)動(dòng)熒光蛋白表達(dá))轉(zhuǎn)錄活性，且與SV40增強(qiáng)子相當(dāng)。

腫瘤特異性啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)目的基因的靶向表達(dá)，增強(qiáng)子能夠協(xié)同啟動(dòng)子顯著增強(qiáng)治療基因的表達(dá)水平。本研究初步篩選、鑒定了HPSE序列中具有增強(qiáng)子活性的3個(gè)DNA片段，為后續(xù)進(jìn)一步篩選和鑒定有活性的增強(qiáng)子序列縮小了序列搜尋范圍，并為將來(lái)利用HPSE增強(qiáng)子進(jìn)行腫瘤基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］VLODAVSKY I，F(xiàn)RIEDMANN Y，ELKIN M，et al.Mammalianheparanase:genecloning expression and function in tumor progression and metastasis［J］.Nat Med，1999，5(7):793-802.

［2］ILAN N，ELKIN M，VLODAVSKY I.Regulation，function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2006，38(12):2018-2039.

［3］SIMIZU S，ISHIDA K，OSADA H.Heparanase as a molecular target of cancer chemotherapy［J］.Cancer Sci，2004，95(7):553-558.

［4］胡良鶴，陳曉鵬.人乙酰肝素酶核心啟動(dòng)子的擴(kuò)增及序列分析［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，28(5):319-321.

［5］陳曉鵬，胡良鶴，王永.人乙酰肝素酶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建和功能分析［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，30(3):314-317.

［6］JASNY B R，ROBERTS L.Solving gene expression［J］.Science，2004，306(5696):629-629.

［7］葛國(guó)朝，陳曉鵬.增強(qiáng)子對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2011，38(3):173-175.

［8］王永，陳曉鵬.克隆猿猴病毒40增強(qiáng)子修飾人乙酰肝素酶基因核心啟動(dòng)子及活性分析［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，31(1):12-18.

［9］盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999:539-540.

［10］LI H S，LIU Y，LI D F，et al.Enhancement of DNA vaccineinduced immune responses by a 72-bp element from SV40 enhancer［J］.Chin Med J，2007，120(6):496-502.

［11］ZHANG W M，XUE L Y，XU Y，et al.Improvement of transcriptional activity of hTERT promoter by SV40 enhancer［J］.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2006，35(11):691-693.