遼 寧 醫(yī) 學(xué) 院 蔣 紅 王宏軍＊ 禹 嫙

中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 李新國

天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院 武新亮

加減銀翹散，以金銀花、連翹為君藥，甘草為佐使藥，引入天花粉為臣藥，符合中獸醫(yī)藥理論，該組方被本課題組命名為銀翹天甘，并已開展了該方的藥理活性研究、藥物劑量配比研究、活性成分研究及含藥血清制備工藝的研究 （耿鳴禹等，2012；王宏軍等，2011；鄒宇等，2009；王宏軍等，2009）。為提高銀翹天甘制劑的浸出率，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取方法為影響因素，以浸膏率及抗菌活性作為評定指標(biāo)優(yōu)化其最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞源性大腸桿菌（CMCC44102），由中國獸藥監(jiān)察所提供；豬鏈球菌，由遼寧醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 中草藥 金銀花、連翹、天花粉、甘草購自易達(dá)中藥飲片有限公司（批號(hào)：20080425），經(jīng)鑒定為正品。

1.1.3 試劑 營養(yǎng)瓊脂 （杭州微生物試劑有限公司，批號(hào)：20070226）；營養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，批號(hào)：20050103，20070226）；無支原體新生牛血清 （杭州天杭生物科技有限公司，批號(hào)：101115）；按照成品培養(yǎng)基說明調(diào)配而成，121℃高壓滅菌20 min后，瓊脂培養(yǎng)基制成平板，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要儀器 YH-350Z型全自動(dòng)不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；QE-200 g型粉碎機(jī)，武義縣屹立工具有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；索氏提取器，天津市北辰區(qū)光明玻璃儀器廠；RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-ⅢB型循環(huán)水真空泵，浙江臨海市精工真空設(shè)備廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組方設(shè)計(jì) 將金銀花、連翹、天花粉、甘草4味藥按比例組方（王宏軍等，2011），粉碎，過60目篩，稱取若干份，以乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取方法作為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平（表 1），進(jìn)行 L9（34）正交試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)因素與水平

1.2.2 中草藥提取 按表1設(shè)計(jì)的因素水平和表2安排的提取工藝條件提取銀翹天甘制劑，減壓濃縮，60℃干燥至恒重，每組重復(fù)3次，按下式計(jì)算浸膏率。

1.2.3 血清培養(yǎng)基的制備 液體培養(yǎng)基冷卻后，配制成含10%血清的液體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基溫度降到55℃左右時(shí)加入血清，配制成含10%血清的培養(yǎng)基，混勻后澆平板，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 試驗(yàn)菌懸液的制備 取菌種0.5 mL放入10 mL適宜的液體培養(yǎng)基中混勻，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h為原菌液。采用活菌計(jì)數(shù)方法推算原菌液中細(xì)菌的個(gè)數(shù)（陳奇，1992）。用滅菌生理鹽水將菌液稀釋到105CFU/mL即為供試菌液。

1.2.5 最小抑菌濃度的測定 用微管-平板法測定最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.6 抗菌活性綜合評分 采用抗菌活性綜合評分（Z）方法，評價(jià)不同工藝制備的銀翹天甘制劑對雞大腸桿菌、豬鏈球菌活性的綜合效應(yīng)，按下式計(jì)算：

式中，X為銀翹天甘制劑對雞大腸桿菌的MIC；Y為銀翹天甘制劑對豬鏈球菌的MIC；i為試驗(yàn)序號(hào)1～9；max為MIC的最大值。

1.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 以浸膏率和抗菌活性為響應(yīng)值，將獲得最優(yōu)工藝按照相應(yīng)方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)6組，以確定銀翹天甘制劑的最優(yōu)提取工藝。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 正交試驗(yàn)采用極差分析法，驗(yàn)證試驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸膏率 由表2可見，極差結(jié)果顯示，4個(gè)因素的顯著順序?yàn)椋篋＞B＞A＞C，最優(yōu)提取工藝為：A3B3C3D3。

2.2 抗菌活性 分別對9個(gè)工藝獲得的銀翹天甘制劑進(jìn)行抗雞大腸桿菌和豬鏈球菌抗菌活性的測定，銀翹天甘制劑對雞大腸桿菌和豬鏈球菌的MIC均在0.125～0.5 g/mL。由表2可見，由抗菌活性綜合評分作為響應(yīng)值，4個(gè)因素的顯著順序?yàn)椋篊＞D＞B＞A，因抗菌活性是MIC值越小表明活性越高（陳奇，1992），故以抗菌活性為響應(yīng)值時(shí)，最優(yōu)提取工藝為：A3B2C2D3或A2B2C2D3。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 分別以浸膏率和抗菌活性綜合評分得到3個(gè)較優(yōu)提取工藝（表3）。由表3可見，工藝2浸膏率達(dá)到最大值60.61%，與工藝1和工藝3均差異極顯著 （P＜0.01）；對雞大腸桿菌的MIC為0.125 g/mL，對豬鏈球菌的MIC為0.177 g/mL，與工藝3差異顯著（P＜0.05）。

表3 銀翹天甘提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 中草藥復(fù)方提取工藝的設(shè)計(jì) 大量研究表明，絕大多數(shù)中草藥復(fù)方提取工藝的試驗(yàn)研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法（陳堅(jiān)平和王思鴻，2008），也有的采用均勻設(shè)計(jì)法（趙瑞芝等，2006），正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法應(yīng)用最為廣泛，簡單易行，不但節(jié)約了大量的時(shí)間而且也節(jié)省了大量的材料。由表2和表3可知，超聲波+索氏提取法能夠提高銀翹天甘制劑的浸膏率，再配合70%乙醇，浸膏率明顯升高；而從抗菌活性方面來看，該方法的影響相對要小很多。

3.2 優(yōu)選提取工藝的評定方法 提取工藝的評定方法，常用的是測定某一成分的含量來進(jìn)行評定，如浸膏重（劉春海等，2006）。陳堅(jiān)平和王思鴻（2008）用正交試驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方當(dāng)歸苦參片的提取工藝研究中以提取液中阿魏酸的含量以及總固體得率的綜合評定為評價(jià)指標(biāo)。在銀翹天甘提取工藝篩選中，認(rèn)為中草藥復(fù)方制劑的浸膏率是未來工業(yè)生產(chǎn)重要關(guān)注點(diǎn)，至于活性成分，也是需要考慮的，但作為一個(gè)中草藥復(fù)方發(fā)揮作用的成分可能不只一種，那么只檢測某一種成分的含量不足以說明問題，所以檢測指標(biāo)引入了藥理活性，金銀花、連翹、甘草均具有抗菌活性，此外，該組方的創(chuàng)制也是以抗細(xì)菌感染為主，故采用浸膏率與抗菌活性作為響應(yīng)值進(jìn)行綜合評定，為該制劑開發(fā)成抗菌口服液奠定基礎(chǔ)。

通過正交試驗(yàn)得出中草藥復(fù)方銀翹天甘的提取工藝為A3B2C2D3即乙醇濃度為70%，提取2次，每次提取1 h，提取方法為超聲波與索氏提取相結(jié)合，浸膏率可達(dá)到60.61%，對雞大腸桿菌的MIC為0.125 g/mL，對豬鏈球菌的MIC為0.177 g/mL。

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