遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院 王維新 白 燕 王 宏 蘇 暢 楊鳳影

刺參是低等無脊椎動物，沒有特異性免疫機(jī)制，但具有較完善的非特異性免疫系統(tǒng)，有對抗病原的吞噬細(xì)胞和免疫因子 （簡紀(jì)常和吳灶和，2002）。免疫增強(qiáng)劑具有廣譜性，對疾病有一定程度的預(yù)防作用，因此開發(fā)免疫增強(qiáng)劑，通過提高非特異性免疫機(jī)能來增強(qiáng)刺參的抗病能力具有重要意義。中草藥含有的免疫活性物質(zhì)主要有多糖、甙類、有機(jī)酸、生物堿、萜類及醇類等揮發(fā)性成分。

本試驗(yàn)利用中醫(yī)理論將多種中草藥配伍，粉碎后直接添加到刺參飼料中，測定與免疫力有關(guān)酶的活性，以期為刺參免疫增強(qiáng)劑的篩選提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康刺參購于遼寧省錦州市金域刺參良種場，體長（4.0±0.35）cm，單體質(zhì)量（3.0±0.45）g。將刺參飼養(yǎng)于塑料水箱中， 水溫 （17±1）℃，pH（8.1±0.2），海水鹽度為（29±2）‰，日投喂 1 次（16∶00）飼料，虹吸法去除殘餌及糞便并換水30%。暫養(yǎng)1周后用于試驗(yàn)。

中草藥配方：黃芪10份、黨參10份、防風(fēng)5份、白術(shù)5份、金銀花2份、連翹2份、維生素C 1份。所用中草藥均購自錦州方圓藥店，粉碎后過200目篩。將粉碎后的中草藥分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%的比例添加到基礎(chǔ)飼料中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)分5組，分別為對照組（投喂基礎(chǔ)飼料）、1%（質(zhì)量百分比）中草藥組、2%中草藥組、3%中草藥組和4%中草藥組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)飼養(yǎng)刺參20頭。共投喂24 d。投喂期間每天監(jiān)測氨氮、亞硝酸鹽、溶氧、pH等水質(zhì)指標(biāo)并觀察刺參生長及健康狀況。

1.3 指標(biāo)測定 于投喂后第 7、10、14、18、24天測定刺參各種免疫指標(biāo)。每次從各重復(fù)組中隨機(jī)取出刺參2頭，解剖取出腸道及呼吸樹，去除腸道中的糞便，混合稱重，玻璃勻漿器充分研磨后離心（10000 r／min，4 ℃，5 min），取上清液，4 ℃保存待用。 酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合酶（NOS）和超氧化物歧化酶（SOD）活性測定使用南京建成試劑盒完成。

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單素方差分析（One-way AN0VA），結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，試驗(yàn)組與對照組做差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 對刺參NOS活性的影響 由表1可見，各試驗(yàn)組在投喂后24 d內(nèi)NOS活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。各試驗(yàn)組第10～24天，NOS活性均與對照組差異顯著 （P＜0.05），口服第18天后，2%復(fù)方中草藥組NOS活性最高，為（17.21±1.05）U/mg prot，是對照組的8.56倍。

表1 刺參內(nèi)臟組織一氧化氮合酶活性測定U/mg prot

2.2 對刺參AKP活性的影響 由表2可見，在飼喂后24 d內(nèi)AKP活性隨時間延長呈先升高后降低的趨勢，各試驗(yàn)組第10～18天，AKP活性均與對照組差異顯著（P＜0.05），第10天，2%復(fù)方中草藥組AKP活性最高，為33.07 U/g prot，是對照組的3.03倍。

2.3 對刺參ACP活性的影響 由表3可見，飼喂后24 d內(nèi)ACP活性呈先升高后降低的趨勢，各試驗(yàn)組第10～18天，AKP活性均與對照組差異顯著（P＜0.05）。其中第14天，2% 復(fù)方中草藥組 ACP活性達(dá)到最高值， 為（36.24±1.87）U/g prot，是對照組的6.14倍。

表2 刺參內(nèi)臟組織堿性磷酸酶活性測定U/g prot

表3 刺參內(nèi)臟組織酸性磷酸酶活性測定U/g prot

2.4 對刺參SOD活性的影響 由表4可見，飼喂后24 d內(nèi)刺參體腔液中SOD活性呈先升高后降低的趨勢，各試驗(yàn)組第10～24天，NOS活性均與對照組差異顯著（P＜0.05）。在口服第18天，3%中草藥組SOD活性最高， 為 （102.15±2.31）U/mg prot，是對照組的2.27倍。

表4 刺參內(nèi)臟組織超氧化物歧化酶活性測定U/mg prot

3 討論

研究表明，NOS能以L-精氨酸為底物在體內(nèi)合成多種與免疫活性有關(guān)的內(nèi)源性NO，從而改變機(jī)體的免疫機(jī)能，并可通過阻止DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成而具有抗菌和抗病毒活性。在本試驗(yàn)中，中草藥添加劑提高了刺參體腔細(xì)胞NOS活性，這與劉紅柏等（2006）和 Karupiah 等（1993）試驗(yàn)結(jié)論一致。

AKP普遍存在于生物細(xì)胞內(nèi)，催化磷酸單脂水解生成乙醇和磷酸的代謝反應(yīng)，并與一些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)。本研究結(jié)果表明，添加不同水平中草藥添加劑后，各試驗(yàn)組刺參內(nèi)臟組織AKP活性均得到提高，且第10、14、18天顯著高于對照組（P＜0.05）。 艾春香等（2002）研究認(rèn)為，維生素C、維生素E作為免疫增強(qiáng)劑可使河蟹AKP活性顯著升高。

ACP是生物體巨噬細(xì)胞內(nèi)最有代表性的水解酶，巨噬細(xì)胞吞噬異物顆粒形成吞噬體，然后利用包括ACP在內(nèi)的溶解酶消化異物顆粒。ACP活性可反映吞噬細(xì)胞清除異物的能力，也就是非特異性免疫能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂含不同水平復(fù)方中草藥添加劑日糧一段時間后，刺參內(nèi)臟組織ACP活性均有不同程度提高，且第10、14、18天與對照組相比差異顯著，這與免疫增強(qiáng)劑在對蝦上應(yīng)用結(jié)論吻合，即顯著提高了ACP活性（江曉路等，1999）。

SOD是重要的抗氧化酶之一，作為活性氧清除劑參與清除體內(nèi)自由基，在防機(jī)體衰老及防生物分子損傷等方面具有極為重要的作用。有研究報道，SOD活性與生物體的免疫水平密切相關(guān)，其對于增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力和整個機(jī)體的免疫功能有重要的作用。本試驗(yàn)中添加不同水平復(fù)方中草藥提高了刺參內(nèi)臟組織中的SOD活性，增強(qiáng)了抗氧化能力，這可能與中草藥成分中的黃酮和皂甙消除氧自由基的作用有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，通過投喂途徑，復(fù)方中草藥添加劑能一定程度增強(qiáng)刺參內(nèi)臟組織中免疫相關(guān)酶ACP、AKP、NOS及SOD的活性。結(jié)合添加量及飼喂時間綜合考慮，飼料中添加2%～3%中草藥添加劑，投喂14～18d可使刺參免疫相關(guān)酶的活力得到較大提高。

[1]艾春香，陳立僑，高露婉，等.維生素C對河蟹血清和組織中超氧化物歧化酶及磷酸酶活性的影響[J].臺灣海峽，2002，21（4）：431 ～ 438.

[2]簡紀(jì)常，吳灶和.中草藥對建鯉非特異性免疫功能的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2002，17（2）：114 ～ 119.

[3]江曉路，劉樹青，牟海津，等.真菌多糖對中國明對蝦血清及淋巴細(xì)胞免疫活性的影響[J].動物學(xué)研究，1999，20（1）：41 ～ 45.

[4]劉紅柏，盧彤巖，張春燕，等.黃芪對史氏鱘抗氧化能力及免疫力的影響[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2006，21（3）：231 ～ 235.

[5]Karupiah G，Xie Q，Buller R，et al，Inhibition of viral replication by interferon induced nitric oxide synthase[J].Science，1993，261：1445 ～ 1448.