東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 張燕華 張秀英＊ 李春艷 徐 尚 李曉沖

隨著生活方式及膳食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的發(fā)病率日趨升高，成為最常見的慢性疾病之一，此病也是動(dòng)物的原發(fā)或繼發(fā)性疾病，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。非酒精性脂肪肝病的發(fā)生伴隨著肝臟的損傷和脂肪變性，脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素等均參與肝臟損傷與修復(fù)，調(diào)節(jié)脂肪的代謝。有研究顯示，非酒精性脂肪肝病患者常有胰島素抵抗（IR），瘦素可以直接作用于胰島β細(xì)胞，減少胰島素分泌，而脂聯(lián)素可以增加胰島素的敏感性（Aygun等，2006），所以當(dāng)機(jī)體代謝紊亂，發(fā)生脂肪肝病變時(shí)，瘦素和脂聯(lián)素的水平也會(huì)改變。

課題組前期研究成功建立了非酒精性脂肪肝的動(dòng)物模型（李曉沖等，2013）。本研究按照前期動(dòng)物模型的建立方法，采用高脂飼料飼喂ICR小鼠，建立ICR小鼠的非酒精性脂肪肝模型，探討飼喂高脂飼料對小鼠脂肪細(xì)胞因子瘦素和脂聯(lián)素的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 小鼠瘦素、脂聯(lián)素和胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購自上海索萊寶生物科技有限公司；膽固醇，由天津虔誠偉業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，批號：20100122；3號膽鹽、糊精均由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，批號：20120202；豬油為超市購買。

1.2 試驗(yàn)方法 雄性ICR小鼠12只，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，隨機(jī)分為高脂組和對照組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)入正式試驗(yàn)，并稱其體重。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，高脂組飼喂高脂飼料，在基礎(chǔ)飼料（68.5%）中加入15%豬油、1%膽固醇、0.5%膽鹽、15%糊精，高脂飼料的配方由前期試驗(yàn)確定（李曉沖等，2013），分別于連續(xù)飼喂4周和8周后，眼球采血處死小鼠，每組3只。小鼠處死前禁食12 h，觀察小鼠的毛色和行為并稱體重，處死后稱小鼠的肝重，并計(jì)算肝指數(shù)：

肝指數(shù)/%=肝濕重/體重×100。

全血3000 r/min離心15 min分離血清，-20℃凍存，血清中的生化指標(biāo)采用Beckman全自動(dòng)生化分析儀，其中谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）采用速率法檢測；甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）采用液體雙試劑酶法檢測；葡萄糖（GLU）采用己糖激酶法測定。血清中的瘦素、脂聯(lián)素和胰島素測定采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 臨床變化 試驗(yàn)過程中，對照組和高脂組小鼠均未出現(xiàn)死亡。高脂組小鼠較對照組瘦小，毛發(fā)不順、蓬亂、無光澤。解剖后發(fā)現(xiàn)，高脂組小鼠的肝臟比對照組大，顏色呈棕黃色。

由表1可見，4周和8周高脂組小鼠的體重相比對照組降低，且差異顯著（P＜0.05），肝重和肝指數(shù)均極顯著的高于對照組（P＜0.01）。

表1 高脂組和對照組小鼠體重、肝重及肝指數(shù)

2.2 小鼠血清生化指標(biāo)的變化 由表2可見，4周和8周高脂組的 ALT、AST、ALP、TC和GLU水平均極顯著或顯著高于對照組 （P＜0.01或P＜0.05），而4周和8周高脂組TG水平與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

表2 高脂組和對照組小鼠血清生化指標(biāo)的比較

2.3 小鼠瘦素、脂聯(lián)素和胰島素的變化 由表3可見，4周和8周高脂組小鼠的瘦素和胰島素均極顯著或顯著高于對照組（P＜0.01或P＜0.05），而4周和8周脂聯(lián)素的水平均極顯著或顯著低于對照組 （P＜0.01或P＜0.05）。與4周高脂組相比，8周高脂組的瘦素、脂聯(lián)素和胰島素水平均升高，但差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

本試驗(yàn)中高脂組小鼠的體重顯著降低，肝臟明顯比對照組大，肝濕重極顯著高于對照組，肝指數(shù)是對照組的2倍多，且肝臟的顏色呈現(xiàn)明顯的棕黃色。高脂組小鼠血清中的ALT、AST、ALP、GLU和TC均比對照組高出1倍多，說明高脂組小鼠體重雖沒有過度增加，但長期飼喂高脂飼料引起了血脂代謝紊亂。根據(jù)非酒精性脂肪肝病診療指南 （中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組，2006）可判斷小鼠在喂養(yǎng)4周后發(fā)生明顯的脂肪肝變化，8周時(shí)各轉(zhuǎn)氨酶水平雖有不同程度的升高或降低，但與4周相比差異不顯著，這與孟衛(wèi)東和范存士（2010）研究報(bào)道的隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，血清學(xué)指標(biāo)均有不同程度升高的結(jié)果相似。

表3 高脂組和對照組小鼠瘦素、脂聯(lián)素和胰島素的比較

目前已有學(xué)者提出非酒精性脂肪肝發(fā)病的機(jī)制為“二次打擊”學(xué)說，即胰島素抵抗和氧化應(yīng)激（Ma 和 Li，2006）。其中第一次打擊“胰島素抵抗”在疾病的發(fā)展中起到重要的作用，胰島素是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)血糖的主要糖皮質(zhì)激素，同時(shí)也具有抑制脂肪分解，降低血液中游離脂肪酸的作用。本研究結(jié)果顯示，高脂組小鼠胰島素和GLU的水平均顯著升高，表明高脂飼料誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了胰島素抵抗，這與Marchesini等（2001）報(bào)道的幾乎所有的非酒精性脂肪肝病患者均存在胰島素抵抗是一致的。

瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種激素樣物質(zhì)，它主要通過抑制食欲，減少能量攝取，增加能量消耗，抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解等途徑調(diào)節(jié)脂肪代謝（Zhang等，1994）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組小鼠血清的瘦素水平顯著高于對照組，說明產(chǎn)生了瘦素抵抗。這與國內(nèi)外的學(xué)者研究結(jié)果一致，Angulo等（2004）報(bào)道，高脂血癥會(huì)使瘦素受體對瘦素不敏感，產(chǎn)生瘦素抵抗。本研究中非酒精性脂肪肝病模型組的瘦素水平和胰島素水平顯著高于對照組，這與Li等（2010）報(bào)道的非酒精性脂肪肝病患者血清瘦素水平與胰島素抵抗成獨(dú)立正相關(guān)相似。機(jī)體內(nèi)存在脂肪-瘦素-胰島素軸，瘦素可以直接作用于胰島β細(xì)胞，減少胰島素分泌。胰島素水平增加可反饋性引起瘦素分泌增加，所以在非酒精性脂肪肝病模型小鼠中，會(huì)產(chǎn)生瘦素抵抗。

脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的一種特異性脂肪細(xì)胞因子，具有抗炎、抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化和增加胰島素敏感的作用（Fang和Sweeney，2006）。本研究表明，非酒精性脂肪肝病模型組小鼠的血清脂聯(lián)素水平顯著低于對照組，這與Philip等（2003）報(bào)道的低脂聯(lián)素血癥是導(dǎo)致高脂組大鼠高脂血癥的原因相符。當(dāng)脂聯(lián)素的水平下降時(shí)，脂肪細(xì)胞對胰島素的敏感性下降，會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，形成脂肪肝。本試驗(yàn)中，非酒精性脂肪肝病模型組小鼠發(fā)生了明顯的胰島素抵抗，說明高脂飼料誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了明顯的低脂聯(lián)素血癥，這與Pagano等（2005）報(bào)道的脂聯(lián)素水平的下降預(yù)示著高胰島素血癥的發(fā)生相一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，8周高脂組小鼠的瘦素和脂聯(lián)素水平與4周高脂組相比無顯著性差異，說明長時(shí)間的喂養(yǎng)并不會(huì)使脂肪相關(guān)因子發(fā)生顯著變化，這與王麗娟和李曉蓉（2007）等報(bào)道的小鼠脂質(zhì)代謝能力強(qiáng)，血脂水平上升后會(huì)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)相似。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，高脂飼料可以誘導(dǎo)小鼠發(fā)生非酒精性脂肪肝變化，且所需周期非常短。在非酒精性脂肪肝病模型組小鼠中，存在著瘦素抵抗和低脂聯(lián)素血癥，瘦素和脂聯(lián)素的水平與胰島素有密切的關(guān)系，但與飼喂時(shí)間的長短無顯著關(guān)系。通過本試驗(yàn)，有理由展望臨床上可以通過控制飲食、補(bǔ)充瘦素或脂聯(lián)素來治療非酒精性脂肪肝病，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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