吳則東 ，王華忠 ，倪洪濤

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)，哈爾濱150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；4.黑龍江大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

近些年來，分子生物學(xué)發(fā)展較快，分子生物學(xué)技術(shù)也已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到作物的多個(gè)領(lǐng)域，例如種子純度的鑒定[1]、構(gòu)建指紋圖譜[2－3]、遺傳多樣性分析[4]、遺傳圖譜的構(gòu)建[5－6]以及植物數(shù)量性狀位點(diǎn)的定位[5]等等，但這一切都有賴于植物基因組DNA的提取。從目前的發(fā)展來看，植物基因組DNA的提取主要有SDS法和CTAB法，雖然還有一些試劑盒可以直接用于植物DNA的提取，但是這些方法一般都是步驟較多，要用到很多藥品，提取過程相對(duì)復(fù)雜，而且還要用到一些有毒的試劑。而甜菜作為世界兩大糖料作物之一，這些年來分子生物學(xué)方面也得到了很大的發(fā)展，目前文獻(xiàn)報(bào)道的甜菜基因組DNA提取主要是利用SDS以及CTAB對(duì)甜菜葉片進(jìn)行提取，而利用堿裂解法對(duì)甜菜大群體進(jìn)行基因組DNA的提取還沒有相關(guān)的報(bào)道，目前見諸文獻(xiàn)應(yīng)用此種方法提取基因組DNA主要是玉米[7-10]、高粱[11]、水稻[12]等作物。本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)肗aOH對(duì)甜菜干種子進(jìn)行DNA的提取，旨在建立一種快速提取甜菜大群體DNA的方法，為將來快速鑒定甜菜品種純度以及真實(shí)性打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的4個(gè)甜菜品系，分別是二倍體遺傳單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系JV7，JV9和JV11，以及1個(gè)四倍體品系TB401。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)中所用的試劑 0.5M的NaOH（現(xiàn)用現(xiàn)配）；瓊脂糖；上樣緩沖液：0.125%的溴酚藍(lán)，0.125%的二甲苯青FF，40%的蔗糖；無水乙醇；丙烯酰胺；甲叉雙丙烯酰胺；硝酸銀；NaOH；甲醛。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)中所用的儀器 伯樂電泳儀；JY-SPAT型水平電泳槽；北京六一的DYCZ-30型電泳槽；離心機(jī)。

1.3 DNA的提取

采用張明永及郭景倫等人[7，10，13]的方法，略加改動(dòng)，采用4種方法進(jìn)行甜菜干種子DNA的提取，每種方法均取每個(gè)樣品的1～3粒干種子（單胚種子3粒，多胚四倍體種子1粒），大約30mg，不同方法前處理不同。①利用100μL 0.5M的NaOH對(duì)胚進(jìn)行研磨，研磨后倒入1.5mL的離心管中，10000r/min離心5min，取出上清液，用100μL無水乙醇洗滌，倒掉上清液，待乙醇揮發(fā)后，加入100μL TE緩沖液，-20℃保存；②利用100μL 0.5M的NaOH對(duì)種子直接進(jìn)行研磨，其它與①相同；③先將干種子的胚取出，打碎后，放入1.5mL的離心管中，再加入100μL 0.5M的NaOH，上下顛倒使NaOH溶液充分浸入到甜菜胚的粉末中去，然后再沸水浴5min，冷卻至室溫后，10000r/min離心5min，取出上清液，用100μL無水乙醇洗滌，倒掉上清液，待乙醇揮發(fā)后，加入100μL TE緩沖液，4℃保存；④將種子直接研磨成粉末，放入1.5mL的離心管中，再加入100μL 0.5M的NaOH，其余步驟與③相同。

1.4 DNA質(zhì)量與數(shù)量的檢測(cè)

取5μL DNA樣品與1μL上樣緩沖液，利用離心機(jī)將其混勻，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性（電泳緩沖液為0.5×TBE）。同時(shí)，加入已知濃度的Lambda DNA，估算DNA樣品的濃度。

1.5 SSR反應(yīng)

⑴SSR引物：本實(shí)驗(yàn)中所用的SSR引物來源于文獻(xiàn)[14-17]，引物由上海生工生物工程公司合成。

⑵SSR反應(yīng)體系：將提取的DNA稀釋到10ng/μL，在20μL反應(yīng)體系中包括模板DNA 4μL，2×Taq PCR master mix 10μL，正反向引物各60ng，其余用無菌雙蒸水補(bǔ)充。

⑶SSR反應(yīng)程序：擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性50s，52℃退火 50s，72℃延伸 50s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10min，最后 4℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的檢測(cè)及純度鑒定

從干種子中提取的DNA利用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用Lambda DNA進(jìn)行定量分析，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，4種方法均從甜菜干種子提取出了DNA，DNA的完整性都很好，而且RNA含量較低；從提取的DNA含量來看，利用NaOH直接研磨胚及種子提取的DNA含量相差不大，從提取的DNA與Lambda DNA對(duì)比結(jié)果來看，利用堿直接研磨不經(jīng)水沸每30mg干種子大約提取DNA 600ng；對(duì)種子和胚研磨后加NaOH再水沸的結(jié)果見圖中后兩組，從圖中我們可以看出，干種子直接研磨處理效果非常好，從與Lambda DNA對(duì)比結(jié)果來看，每30mg干種子提取DNA超過 1μg；而胚研磨水沸的效果則比較差，是4種方法中提取DNA最少的一種，含量較低。

圖1 4種方法提取DNA瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果

2.2 SSR結(jié)果分析

利用提取DNA量最多的第四種方法獲得的DNA對(duì)前3個(gè)單胚樣品進(jìn)行SSR-PCR分析，并利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測(cè)，銀染結(jié)果見圖2。從圖2我們可以看出，利用NaOH提取的甜菜干種子DNA，雖然減少了很多常規(guī)提取DNA的環(huán)節(jié)，里面有些雜質(zhì)也沒有完全去除干凈，但依然能夠擴(kuò)增出清晰的條帶，完全能夠滿足SSR擴(kuò)增的需要。

圖2 8%聚丙烯酰胺凝膠銀染圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用堿裂解法首次從甜菜干種子中提取到了DNA，通過不同提取方法的對(duì)比，確立了先對(duì)種子進(jìn)行研磨，然后再加NaOH溶液，沸水處理5min為最佳提取甜菜大群體DNA的方法。本方法僅使用2～3粒甜菜單胚種子就可以在10幾分鐘的時(shí)間內(nèi)提取到超過1μg的DNA，而且提取的DNA完整性好，RNA含量極低，能很好地應(yīng)用于SSR反應(yīng)，因?yàn)閼?yīng)用本方法不需要使用液氮以及有毒的氯仿、苯酚等等，由于是直接使用干種子進(jìn)行DNA的提取，所以也省去了種子發(fā)芽或者利用真空冷凍干燥機(jī)[18]對(duì)葉片的處理，另外由于甜菜種子研磨比較容易，所以不需要使用粉碎機(jī)[19]或者電鉆[20]進(jìn)行種子的粉碎，實(shí)驗(yàn)方法大大的簡(jiǎn)化。將來隨著甜菜分子指紋圖譜的建立，一個(gè)普通的分子實(shí)驗(yàn)室完全可以在一天內(nèi)僅僅利用甜菜種子就可以對(duì)上百份樣品完成品種的純度及真?zhèn)蔚蔫b定。本方法由于其簡(jiǎn)單、易操作、步驟少等優(yōu)點(diǎn)能夠更好地促進(jìn)甜菜分子生物學(xué)向?qū)嵱眯陨峡焖侔l(fā)展。

[1]盧銳，葉永亮，馮國(guó)軍.EST-SSR 標(biāo)記在黃瓜 F1種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].北方園藝，2010（18）：136-138.

[2]胡景濤，黃文章，嚴(yán)明建，等.十二份三系雜交稻親本的指紋圖譜構(gòu)建與應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（10）：2122-2124.

[3]劉逢舉，王冰，楊付新.中棉所系列棉花雜交種12個(gè)親本的SSR指紋圖譜構(gòu)建與應(yīng)用[A].中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2012年年會(huì)暨第八次代表大會(huì)[C].山西運(yùn)城，2012： 58-61.

[4]王茂芊，吳則東，王華忠.利用 SRAP標(biāo)記分析我國(guó)甜菜三大產(chǎn)區(qū)骨干材料的遺傳多樣性[J].作物學(xué)報(bào)，2011，37（5）：811-819.

[5]Grimmer M，Trybush S，Hanley S，et al.An anchored linkage map for sugar beet based on AFLPSNPandRAPDmarkersandQTLmapping of a new source of resistance to beet necrotic yellow vein virus[J].TAG Theoretical and Applied Genetics，2007，114（7）：1151-1160.

[6]Rae S，Aldam C，Dominguez I，et al.Development and incorporation of microsatellite markers into the linkage map of sugar beet（Beta vulgaris spp.）[J].TAG Theoretical and Applied Genetic，2000，100（8）：1240-1248.

[7]郭景倫，趙久然，尉德銘，等.玉米單粒種子 DNA 提取新方法[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997（2）：2-3.

[8]譚君，楊俊品.玉米種子DNA快速提取及雜交種純度的快速鑒定[J].分子植物育種，2009，7（4）：811-816.

[9]閆米格，許晶，駢躍斌，等.玉米種子純度鑒定中 DNA 提取方法的比較研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（9）：7-8，14.

[10]郭景倫，趙久然，王鳳格.適用于SSR分子標(biāo)記的玉米單粒種子DNA快速提取新方法[J].玉米科學(xué)，2005（2）：16-17，25.

[11]鄭卓，李健，圣忠華，等.高粱總 DNA 不同提取方法的比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，35（36）：11758-11759.

[12]田潔，羅科.水稻總 DNA 的快速制備[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004，10（2）：143-145.

[13]張明永，孫彩云，梁承鄴.一步法提取植物 DNA 用于大規(guī)模 RAPD 分析[J].遺傳，2000（2）：106.

[14]Cureton A，Burns M，F(xiàn)ord‐Lloyd B，et al.Development of simple sequence repeat（SSR） markers for the assessment of gene flow between sea beet（Beta vulgaris ssp.maritima） populations[J].Molecular Ecology Notes，2002，2（4）：402-403.

[15]Smulders MJ，Esselink GD，Everaert I，et al.Characterisation of sugar beet（Beta vulgaris L.ssp.vulgaris） varieties using microsatellite markers[J].BMC genetics，2010，11：41.

[16]Laurent V，Devaux P，Thiel T，et al.Comparative effectiveness of sugar beet microsatellite markers isolated from genomic libraries and GenBank ESTs to map the sugar beet genome[J].TAG Theoretical and applied genetics Theoretische und angewandte Genetik，2007，115（6）：793-805.

[17]Richards CM，Brownson M，Mitchell SE，et al.Polymorphic microsatellite markers for inferring diversity in wild and domesticated sugar beet（Beta vulgaris）[J].Molecular Ecology Notes，2004，4（2）：243-245.

[18]靖相密，褚云霞，湯庚國(guó)，等.不同保存方法對(duì)蠟梅總DNA提取效果的影響及ISSR-PCR驗(yàn)證[J].分子植物育種，2008，6（2）：387-392.

[19]趙艷麗，劉國(guó)琴.一種快速提取小麥 DNA 的方法[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，23（3）：62-65.

[20]高玉峰，張攀，郝曉敏，等.一種快速提取玉米大群體基因組DNA的方法[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，16（6）：32-36.