吳則東 ，王華忠 ，馬龍彪 ，王茂芊

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱 150080）

甜菜是我國北方重要的經(jīng)濟(jì)作物，建國后，我國的甜菜育種事業(yè)開始起步，從引進(jìn)國外的品系到育成自己的甜菜品種。而甜菜的種植面積也由建國時的1.59萬公頃增加到1998年的41.5萬公頃[1]，此后，我國甜菜種植面積開始萎縮，目前甜菜種植面積基本維持在22萬公頃[2]。從2000年開始，國外的甜菜品種開始進(jìn)入我國，并陸續(xù)占領(lǐng)中國甜菜種子市場，目前國外甜菜品種已經(jīng)占到中國甜菜種子市場的95%以上，其中德國KWS公司是外國公司在我國甜菜種子方面開展活動時間最長、范圍最廣、推出品種及育種材料最多、種子繁殖及銷售量最大的公司[3]。而德國斯特儒博公司的甜菜品種近幾年來在我國的種植面積也在逐年增大。

目前我國對甜菜品種的鑒別依然采用形態(tài)學(xué)的方法，此種方法不僅鑒定周期長，而且準(zhǔn)確率差。由于SSR標(biāo)記具有簡單、共顯性、條帶清晰、重復(fù)性好等特點已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到作物品種指紋圖譜的構(gòu)建[4]。目前甜菜SSR引物已經(jīng)有上千對[5]，完全能夠滿足品種指紋圖譜的構(gòu)建。筆者選擇生產(chǎn)上大面積推廣種植的德國品種KWS0143、KWS2409、KWS5145[6]，以及近幾年剛剛審定命名的德國品種，利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建，以期為品種鑒定以及維護(hù)育種公司以及農(nóng)民的利益提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗用的11份德國進(jìn)口的甜菜品種分別來自于德國的KWS公司和斯特儒博公司，所有的品種均由國內(nèi)甜菜研究機(jī)構(gòu)提供。品種名稱及來源見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將11份甜菜種子播種于黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)溫室營養(yǎng)缽中，待長到4片真葉時，每個品種取10株，經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)處理后，將葉片打磨成干粉，利用堿裂解法[7]快速提取甜菜基因組DNA，經(jīng)λDNA 檢測后，最后稀釋到 10ng/μL。

1.2.2 引物 我們從黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院重點實驗室篩選出來的核心引物中選擇了5對多態(tài)性相對較高、帶型清晰、易分辨且重復(fù)性好的引物，它們是 SB09[8]、S6、S7[9]、SB04[8]和 S2[9]（表 2），引物由上海生工合成，HAP 純化，每對引物均按照說明稀釋到10μM的工作液。

1.2.3 SSR體系及 PCR程序 反應(yīng)體系為 10μL，其中包括 10×PCR buffer 1μL， 模板 DNA 1μL，0.5μL dNTPs（2.5mM each），10μM的正反向引物各0.4μL，Taq DNA聚合酶0.5U，最后加滅菌去離子水至總體積10μL。 PCR 程序：95℃預(yù)變性 1min，然后 94℃變性 40s，54℃退火 40s，最后 72℃延伸 40s，35個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，再72℃延伸5min，4℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物于8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，然后采用快速銀染法[10]顯色并照相記錄。

表1 品種來源及其編號

表2 SSR核心引物及其序列

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 每個電泳的泳帶按照分子量從大到小進(jìn)行記錄，在相同的位置上，有帶記為1，無帶記為0，利用0和1數(shù)字構(gòu)建11個品種的指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物的擴(kuò)增

SSR擴(kuò)增銀染結(jié)果見圖1，從圖中我們可以看出，每對引物均擴(kuò)增出了清晰的條帶，每條引物擴(kuò)增出的條帶最多是8條，最少是2條，這5對引物共擴(kuò)增出34個條帶，其中31個為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶占到總條帶的91.17%。

圖1 8%聚丙烯酰胺凝膠銀染圖

2.2 SSR指紋圖譜的構(gòu)建

雖然我們選擇的4對SSR引物均具有很高的多態(tài)性，但是由于甜菜的遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，所以任何單一的一對引物都不能夠?qū)⑺械?1個甜菜品種區(qū)分開來，從銀染圖可以清晰地看出，單獨的SB04可以區(qū)分開2、3和9號品種，S6能夠區(qū)分開4、10和11號品種，S7能夠區(qū)分開1、3和7號品種，S2能夠區(qū)分開1、5和8號品種，而SB09中沒有特異性的條帶，不能單獨用于品種的區(qū)分。除了6號品種外，其余10個品種的鑒別只需要利用能夠區(qū)分此品種的引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后再和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對，就可確認(rèn)品種的真?zhèn)渭捌浼兌?。而利用S6和S7兩對引物就可以很好地把6號品種區(qū)分開。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的品種純度鑒定的方法大都采用形態(tài)學(xué)鑒定法，形態(tài)學(xué)鑒定法不僅周期長，而且鑒定的效果差，容易受到環(huán)境條件的影響。而以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的品種純度和真實性的鑒定技術(shù)不受環(huán)境條件的影響，鑒定時間短，準(zhǔn)確度高。而目前的分子標(biāo)記技術(shù)中，RAPD重復(fù)性較差，AFLP不僅有專利條件的限制，而且操作復(fù)雜，一般的實驗室難以掌握，而SRAP條帶較多，統(tǒng)計困難[11]；SSR分子標(biāo)記因其條帶較少、統(tǒng)計方便、重復(fù)性好而在種子純度和真實性鑒定中備受青睞。目前國家品種鑒定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)都是以SSR分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的，如GB/T1433-2007《三系雜交水稻及親本真實性和品種純度鑒定DNA分析方法》、NY/T1433-2007《水稻品種鑒定DNA指紋方法》、NY/T1432-2007《玉米品種鑒定DNA指紋方法》、DB51/T808-2008《雜交玉米品種真實性和純度SSR分子檢測技術(shù)方法》等等[12]。本文利用特殊引物法及指紋技術(shù)首次構(gòu)建了11個德國引進(jìn)品種的指紋圖譜，為解決將來可能出現(xiàn)的品種糾紛打下了堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。

致謝：非常感謝內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜研究所、新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所、新疆石河子農(nóng)科中心甜菜研究所在甜菜品種提供上給予的幫助。

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