王 琳，祝美珍，肖艷芬，楊仕權(quán)，吳志敏，劉向陽

腦缺血預處理（brain ischemic preconditioning，BIP）是指對腦組織采用機械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，誘導腦組織產(chǎn)生內(nèi)源性保護機制，使其對以后較長時間的缺血性損傷產(chǎn)生顯著的耐受。近年來研究發(fā)現(xiàn)，微管相關(guān)蛋白1B（microtabule associated protein 1B，MAP1B）屬于神經(jīng)組織特異表達的蛋白質(zhì)，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中最先表達的微管相關(guān)蛋白［1－3］，在分化成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中，一旦發(fā)生損傷，MAP1B也會高水平表達，通過調(diào)節(jié)軸突生長錐的生長方向、促進軸突的延長及再髓鞘化對 神經(jīng)的生長 和 再 生 起 作 用［1，2，4－6］。 本 實 驗 通 過 建立大鼠局灶性腦缺血預處理模型，從神經(jīng)再生角度觀察清熱化瘀Ⅱ號方與BIP共同作用對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用，為臨床缺血性腦卒中的治療和二級預防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 SPF級健康SD大鼠126只，體重（250±50）g，廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2003－0003，使用許可證號：SYXK桂2003－0005。

1.1.2 試劑來源 RNAprep pure（DP431）動物組織總RNA提取試劑盒（離心柱型）、TIANScript mRNA第一鏈合成試劑盒（KR104）、RNAstore樣本保存液（DP408－01）均購自天根生化科技（北京）有限公司；EB溴化乙淀（M1421－1）購自上海凱博生物有限公司；西班牙瓊脂糖（111860）購自上海川翔生物科技有限公司；MAP1B及β－actin引物均由生工生物工程（上海）有限公司設計合成，大小分別為292bp、432bp。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 清熱化瘀Ⅱ號方（水牛角、水蛭、赤芍、地龍、石菖蒲等12味中藥組成）單味中藥濃縮顆粒劑，江蘇省江陰市江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：0904099。給藥容積為14 mL／kg，其等效劑量按體表面積折算為14g／（kg·d）。

1.2.2 動物模型的制備 采用大腦中動脈二次線栓法［7］制備大鼠腦缺血預處理模型，結(jié)扎大鼠左頸外動脈遠端和頸總動脈近端，將前端用火焰燒圓的尼龍線從頸總動脈殘端插入，進線約18mm～20mm，大腦中動脈栓塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO）后10min抽出線栓，完成預缺血。3d后再次行MCAO 2h，規(guī)定時間點處死動物取腦。

1.2.3 分組及處理 SPF級健康SD大鼠126只，隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、腦缺血預處理組、清熱化瘀Ⅱ號方組。除正常對照組外每組按照再灌注后3h、6h、12 h、24h、48h5個時間點平均分為5個亞組，每組6只，分別作如下處理。正常對照組不作任何處理，正常飼養(yǎng)。腦缺血預處理組MCAO 10min后抽出栓線，完成預缺血，3d后再次行MCAO 2h，再灌注后3h、6h、12h、24h、48h處死大鼠。清熱化瘀Ⅱ號方組：缺血預處理10min后，在大鼠麻醉清醒后1h灌胃清熱化瘀Ⅱ號方溶液，連續(xù)3d，每天上午、下午各1次。3 d后給予2hMCAO，大鼠手術(shù)醒后繼續(xù)灌胃中藥直至再灌注后3h、6h、12h、24h、48h處死大鼠。假手術(shù)組：以假手術(shù)代替預缺血及缺血再灌注，線栓只插入頸內(nèi)動脈9mm。腦缺血再灌注組：以假手術(shù)代替預缺血，線栓只插入頸內(nèi)動脈9mm，其余步驟同腦缺血預處理組。

1.2.4 神經(jīng)功能缺損評分 全部MCAO大鼠于缺血3h后按時間點由1名不知情的實驗觀察員按Longa’s的5級神經(jīng)功能缺損評分法進行評分。評分標準：正常，未見任何神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)為0分，垂直提起時前爪不能伸直為1分，行走時身體向右傾，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分，行走時身體向右側(cè)跌倒為3分，不能自發(fā)行走或有意識障礙為4分。積分越高，動物行為障礙越嚴重。阻塞2h后，評分1分以上方視為MCAO阻塞成功，即評分為1分～3分者納入試驗組，0分和4分者均被剔除，同時按要求及時補充大鼠入組。

1.2.5 取材及處理 實驗前所有器械經(jīng)0.1%DEPC水過夜浸泡，按照時間點將大鼠用10%水合氯醛（0.35mL／100g）腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦，取出后放置生理鹽水中漂洗殘血，取海馬后用無RNase的手術(shù)刀片切成任何一邊的最大厚度都小于0.5cm的小塊，放置在已放有10倍組織體積的RNAstore樣本保存液的無RNase離心管中，4℃靜置過夜?jié)B透，然后將組織從RNAstore中取出后放入－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT－PCR法檢測大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞MAP1B表達

1.3.1 提取總RNA 按照動物組織總RNA提取試劑盒提取RNA，得到RNA溶液50μL于－70℃保存。

1.3.2 引物和內(nèi)參選擇 反應中MAP1B上游引物為5′－TCCAACCTTGACAGACACAATC－3′，下游引物5′－TCCAGAAGCAGGACTTTCTTTC－3′，擴增產(chǎn)物為292bp。內(nèi)參β－actin上游引物序列為5′－TCAGGTCATCACTATCGGCAAT－3′，下游引物序列為5′－AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA－3′擴增產(chǎn)物為432bp。

1.3.3 PCR反應步驟 分別以正常對照組及各實驗組總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄反應，反應體系及步驟參考試劑盒說明，反應結(jié)束后取反應液進行PCR，PCR反應體系20μL，配制同試劑說明。反應步驟為：加入Taq酶1μL，然后94℃30s，55℃30s，72℃60s，循環(huán)30次，末次循環(huán)后均于72℃延伸5 min。取PCR擴增產(chǎn)物5μL，15g／L瓊脂糖凝膠，于0.5×TBE緩沖液中，70V電壓電泳，溴化乙啶染色，凝膠成像儀成象并保存結(jié)果。用圖像分析系統(tǒng)掃描定量并數(shù)碼成像，使用Alpha－VIEW SA軟件測量各條帶灰度值。

1.3.4 基因表達強度及其計算 采用目的基因灰度值與內(nèi)參基因灰度值的相對比來表示目標基因的表達強度，即相對比＝目的基因條帶灰度值／β－actin條帶灰度值，灰度值直接反映目的基因和內(nèi)參條帶的亮度，亮度與基因的量相對應。

1.4 統(tǒng)計學處理 對于RT－PCR凝膠條帶灰度值的相對比經(jīng)方差分析，在符合方差齊性的條件下，進行兩因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

2.1.1 神經(jīng)功能評價剔除例數(shù) 對實驗造模各時間點后大鼠進行評分后，有4只評分不符合標準未納入實驗。解剖原因顯示有2只為蛛網(wǎng)膜下腔出血，1只沒有明顯神經(jīng)功能缺損，1只為未知原因死亡，考慮和感染或動物個體差異有關(guān)。

2.1.2 神經(jīng)功能缺損評估結(jié)果 大鼠左側(cè)大腦中動脈阻塞2h再灌注后各時間點，正常對照組和假手術(shù)組均無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，評分為0分，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；其余3組均出現(xiàn)神經(jīng)損傷癥狀，表現(xiàn)為左側(cè)Honer’s征，右前肢屈曲、內(nèi)收；身體向偏癱側(cè)劃圈，腦缺血再灌注組尤為顯著（P＜0.01）。缺血預處理組和清熱化瘀Ⅱ方組與腦缺血再灌注組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其行為評分說明缺血預處理和清熱化瘀Ⅱ方能改善大鼠神經(jīng)損傷癥狀。詳見表1。

表1 各組大鼠再灌注各時間點的神經(jīng)功能缺損評分比較（±s）分

表1 各組大鼠再灌注各時間點的神經(jīng)功能缺損評分比較（±s）分

3h 6h 12h 24h 48h正常對照組組別 n 6 0 0 0 0 0假手術(shù)組 6 0 0 0 0 0腦缺血再灌注組 6 2.33±0.781） 2.58±0.671） 2.25±0.751） 2.33±0.891） 2.42±0.901）腦缺血預處理組 6 2.03±0.62 1.98±0.642） 1.96±0.782） 1.82±0.732） 1.87±0.672）清熱化瘀Ⅱ方組 6 1.83±0.723） 2.00±0.74 1.91±0.90 1.92±0.51 1.58±0.793）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，2）P＜0.01；與腦缺血預處理組比較，3）P＜0.01

2.2 MAP1B蛋白表達變化 RT－PCR分析結(jié)果顯示，正常對照組和假手術(shù)組均有MAP1BmRNA表達，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），腦缺血再灌注組在12h時缺血側(cè)海馬區(qū)MAP1B mRNA表達至高峰，隨再灌注時間延長其表達逐漸下降，但與仍明顯高于正常對照組（P＜0.01）；與腦缺血再灌注組相比，腦缺血預處理組在12h、24h、48h時表達均有明顯升高（P＜0.01）；與腦缺血預處理組相比，清熱化瘀Ⅱ方組在48h時表達水平進一步增高（P＜0.05）。說明清熱化瘀Ⅱ號方聯(lián)合BIP有進一步上調(diào)MAP1B從而起到腦保護的作用。詳見表2。

表2 腦缺血海馬區(qū)MAP1BRT－PCR平均灰度值比較（±s）

表2 腦缺血海馬區(qū)MAP1BRT－PCR平均灰度值比較（±s）

3h 6h 12h 24h 48h正常對照組 6 1.50±0.05 1.50±0.05 1.50±0.05 1.50±0.05 1.組別 n 50±0.05假手術(shù)組 6 1.51±0.03 1.49±0.09 1.53±0.14 1.48±0.09 1.55±0.06腦缺血再灌注組 6 1.60±0.1171）2） 1.63±0.121）2） 1.77±0.241）2） 1.73±0.051）2） 1.72±0.071）2）腦缺血預處理組 6 1.62±0.15 1.67±0.06 1.85±0.083） 1.86±0.093） 1.89±0.083）清熱化瘀Ⅱ號方組 6 1.67±0.15 1.75±0.06 1.90±0.17 1.97±0.09 1.99±0.104）與正常對照組比較，1）P＜0.01；與假手術(shù)組相比，2）P＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，3）P＜0.01；與腦缺血預處理組相比，4）P＜0.05

3 討 論

神經(jīng)再生是神經(jīng)科學研究中的一項重要課題，也是臨床醫(yī)學上亟待解決的問題之一。探討促進腦神經(jīng)元突起的側(cè)支再生與功能重塑的手段，以爭取最佳的康復機會，是缺血性腦損傷康復研究領(lǐng)域的嶄新課題，如能通過藥物激發(fā)機體內(nèi)源性物質(zhì)對腦缺血發(fā)揮保護作用，則是神經(jīng)保護的新途徑，藥物預處理被認為是比較適用于臨床缺血性腦血管疾病的預防和改善預后的方法，在確認安全性的前提下，對缺血性腦血管疾病高危人群有相當?shù)膶嵱脙r值。西醫(yī)在藥物預處理研究取得了一定的進展，但尚未找到理想的預處理藥物。而中藥以其療效明顯、副反應小、多靶點的作用途徑而成為缺血預處理研究的熱點。

清熱化瘀Ⅱ號方是以清熱解毒，化瘀通絡立法來治療缺血性中風，解毒以對抗損害因素是為祛邪，通絡以暢行氣血是為扶正。方中水牛角清熱化瘀、解毒，加之水蛭善破血逐瘀，地龍搜風通絡，石菖蒲醒腦開竅?，F(xiàn)代藥理研究水牛角與犀角角蛋白中氨基酸種類含量相近，故方中用水牛角代替犀角，具有強心、鎮(zhèn)靜、解熱等作用，可使血小板計數(shù)增加，凝血時間縮短。水蛭中含有的水蛭素抗血栓素、肝素樣物質(zhì)，能激活纖溶系統(tǒng)，促使已形成的纖維蛋白溶解而與抗血栓形成一致，石菖蒲對腦缺血再灌注損傷具有降低細胞凋亡率、抑制腦電活動和降低腦水腫的作用［8，9］。本方經(jīng)臨床實驗證實是對腦梗死急性期有確切治療作用的中藥復方制劑［10－12］，但其神經(jīng)保護機制有待于進一步闡明。

微管相關(guān)蛋白（microtubule associatedproteins，MAPs）又稱微管協(xié)同蛋白、微管維系蛋白，與微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合、穩(wěn)定及動力學特性相關(guān)。其中成員之一微管相關(guān)蛋白1B是微管間“橋”的主要成分，參與微管蛋白聚合成微管的過程，并使微管穩(wěn)定聚合成束，從胞體延伸到軸突末端［13］，而且對Schwann細胞在軸突再生時形態(tài)的改變起一定的支持作用，即促進軸突的再髓鞘化等［14］。MAP1B在神經(jīng)系統(tǒng)中的主要作用包括以下幾個方面［1，2，4－6］：在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段影響神經(jīng)元的塑形和遷移；促進生長軸突的延長；引導軸突生長錐的生長方向；促進再生軸突的再髓鞘化等。目前國內(nèi)外對MAP1B蛋白在神經(jīng)損傷、脊髓損傷及腦缺血損傷等方面都有研究，MAP1B在神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、再生中的功能有了一定的闡述，但其促進神經(jīng)再生的具體機制仍不清楚。一般認為MAP1B主要通過磷酸化和非磷酸化形式的相互轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)軸突的生長。

本研究利用RT－PCR方法檢測神經(jīng)細胞軸突特異蛋白MAP1BmRNA表達量，了解MAP1B在大鼠腦神經(jīng)細胞缺血及預處理過程中的表達情況，通過其表達量反映出細胞損傷及修復過程中神經(jīng)突起的生長和增生狀態(tài)，從而推斷出清熱化瘀Ⅱ號方對細胞突起的延伸和神經(jīng)元生長的影響和促進作用。實驗發(fā)現(xiàn)，腦缺血2h再灌注12h缺血側(cè)海馬區(qū)MAP1BmRNA表達至高峰，隨再灌注時間延長其表達逐漸下降，而BIP干預后其表達在12h、24h、48h時均有明顯的升高，提示BIP可能通過影響MAP1B的表達而保護神經(jīng)細胞，而聯(lián)合清熱化瘀Ⅱ號方預處理后MAP1B的表達進一步升高，提示清熱化瘀Ⅱ號方聯(lián)合BIP通過上調(diào)MAP1B的表達有可能通過促進突觸再生和重塑而發(fā)揮缺血后腦保護的作用。這些結(jié)果可能為I／R損傷的治療提供新靶點和新思路。

［1］Gonzalez－Billault C，Jimenez－Mateos EM，Avila J，et al.Microtubule－associated protein 1Bfunction during normal development，regeneration，and pathological conditions in the nervous system［J］.J Neurobiol，2004，58：48－59.

［2］Ma D，Nothias F，F(xiàn)ischer I，et al.Differential regulation of microtubule－associated protein 1B（MAP1B）in rat CNS and PNS during development［J］.J Neuro Res，1997，49：319－332.

［3］Tucker RP，Garner CC，Matus A.In situ localization of microtubule－associated protein mRNA in the developing and adult rat brain［J］.Neuron，1989，2：1245－1256.

［4］Tsutomu A，Carl F.Interaction of microtubule－associated proteins with actin Filaments［J］.JBC，1984，259：11730－11734.

［5］Ding J，Liu JJ，Kowal AS，et al.Microtubule－associated protein 1B：A neuronal binding partner for gigaxonin［J］.J Cell Biology，2002，158：427－433.

［6］Sandra LT，Rachelle F，Howard J，et al.Evidence for expression of some microtubule－associated protein 1Bin neurons as a plasma membrane glycoprotein［J］.J Neurochemistry，2000，75：553－562.

［7］郝玉曼，羅祖明，周東.局灶預缺血誘導腦缺血耐受的動物模型［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2003，20（2）：129－130.

［8］匡忠生，謝字暉，李玲，等.石菖蒲提取液對腦缺血再灌注誘導的神經(jīng)細胞凋亡保護作用［J］.廣州醫(yī)學，2002，23（5）：459.

［9］方永奇，李翎，鄒衍衍，等.石菖蒲對缺血再灌注腦損傷大鼠腦電圖和腦水腫的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2003，12（6）：55－57.

［10］祝美珍，肖健，肖艷芬，等.清熱化瘀Ⅱ號方對急性腦梗死患者神經(jīng)功能及全血ICAM－1、CD62P表達的影響［J］.廣西醫(yī)科大學學報，2011，28（4）：546－548.

［11］祝美珍，吳志敏，肖健，等.清熱化瘀Ⅱ號方對缺血性中風急性期神經(jīng)功能及S100B蛋白表達的影響［J］.廣西中醫(yī)藥，2011，34（4）：192－194.

［12］祝美珍，王琳，胡躍強，等.清熱化瘀Ⅱ號方對急性缺血性中風患者神經(jīng)功能及中醫(yī)證候評分的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011，9（8）：950－952.

［13］Sato Yoshitake R，Shiomura Y，Miyasaka H，et al.Microtubuleassociated protein 1B：Molecular structure，localization，and phosphorylation－dependent expression in developing neurons［J］.Neuron，1989，3：229－238.

［14］Ma D，Connors T，F(xiàn)ischer I，et al.Regulation of the expression and phosphorylation of microtubule－associated protein 1Bduring regeneration of adult dorsal root ganglion neurons［J］.Neurosci，2000，99：157－170.