曹成章，郭 麗，燕 子，溫永金，王 潔，郭 勇，梁 峰

近年來，隨著現(xiàn)代工業(yè)、建筑業(yè)、交通運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，中國人群疾病模式發(fā)生改變，機(jī)械創(chuàng)傷日益成為嚴(yán)重危害人群健康的公共衛(wèi)生問題，并且已成為我國45歲以下人群的首要死亡原因［1］。近年來，隨著院前急救體系的建立和逐步完善，及創(chuàng)傷救治最佳時(shí)間理念的推廣，創(chuàng)傷急救的效果得到了大幅度提高［2］，然而最近的 臨 床 研 究 報(bào) 道［2，3］和 實(shí) 驗(yàn) 研 究［4，5］顯 示，一 些創(chuàng)傷患者傷后24h內(nèi)一般情況良好，沒有直接的機(jī)械性心臟損害，但出院后卻發(fā)生了遲發(fā)性心臟損傷，最終導(dǎo)致心臟功能障礙。在創(chuàng)傷直接導(dǎo)致的和創(chuàng)傷后立刻出現(xiàn)的組織損傷已得到有效控制時(shí)，這種遲發(fā)性的生命器官損傷成為威脅創(chuàng)傷患者的潛在殺手。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)機(jī)械創(chuàng)傷患者的關(guān)注，探討創(chuàng)傷后機(jī)體出現(xiàn)遲發(fā)性生命器官的損傷的可能征兆，以防漏診。國內(nèi)外研究表明，使用Noble－Collip創(chuàng)傷儀制備大鼠機(jī)械創(chuàng)傷模型，可以用于模擬臨床機(jī)械創(chuàng)傷致遲發(fā)性心功能障礙的患者［4－6］。本研究通過制備大鼠機(jī)械創(chuàng)傷模型，觀察創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)情況、炎癥活動(dòng)性等指標(biāo)，篩選出一種可能的指標(biāo)，幫助降低創(chuàng)傷后發(fā)生遲發(fā)性心臟功能減退患者的臨床漏診率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取成年雄性Wistar大鼠100只（意外死亡4只），體重200g～250g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為偽創(chuàng)傷組、輕度創(chuàng)傷組和中度創(chuàng)傷組，各組根據(jù)創(chuàng)傷后時(shí)間又分為創(chuàng)傷后0h、6h、12h、24h組，每組8只。

1.2 主要藥品與試劑 大鼠腎上腺素（NE）ELISA試劑盒；大鼠超敏C反應(yīng)蛋白（hs－CRP）ELISA試劑盒；大鼠血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）試劑盒：上海西唐生物有限公司。

1.3 主要儀器 Noble－Collip創(chuàng)傷儀（美國Thomas Jefferson大學(xué)急診醫(yī)學(xué)部惠贈(zèng)），S／N E10023酶標(biāo)儀（美國 Molecular Devices公司），低溫高速離心機(jī)（法國Thermo Electron Corporation），DY89－1型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），Millipore純水、超純水系統(tǒng)（美國 Millipore Corporation），MP5002電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），微量移液器（美國Genex Corporation），超低溫冰箱（美國Forma科學(xué)儀器廠）。

1.4 機(jī)械創(chuàng)傷大鼠模型的制備 按照前期研究方法制備機(jī)械創(chuàng)傷大鼠模型。戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠后，將大鼠放入 Noble－Collip創(chuàng)傷儀中，以40r／min的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)200圈，大鼠在轉(zhuǎn)動(dòng)過程中由高處跌落造成機(jī)械性創(chuàng)傷制備機(jī)械創(chuàng)傷大鼠模型。偽創(chuàng)傷組大鼠則固定于創(chuàng)傷儀中，只隨同創(chuàng)傷儀轉(zhuǎn)動(dòng)而不由高處跌落。創(chuàng)傷組和偽創(chuàng)組大鼠均于創(chuàng)傷后0 h、6h、12h、24h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腹腔采血，血液靜置30min后以2 000r／min，離心10min，分離血清。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，利用BCA試劑盒對(duì)血清進(jìn)行蛋白的定量。標(biāo)本在蛋白總量相同的情況下ELISA測(cè)定AngⅡ、NE和hs－CRP實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.5 大鼠離體心功能的檢測(cè) 猛擊大鼠枕部致昏后，立即開胸取出心臟，把心臟置于預(yù)冷的Krebs－Henseleit液（K－H液）中，修剪后將主動(dòng)脈懸掛于Langendorff灌流裝置上，用充以95%O2與5%CO2混合氣體的K－H液灌流。K－H液的成分為：118 mmol／L NaCl，4.75mmol／L KCl，1.19mmol／L KH2PO4，1.19mmol／L MgSO4·7H2O，2.54mmol／L CaCl2·2H2O，25 mmol／L NaHCO3，0.5mmol／L EDTA，11mmol／L Glucose（pH＝7.4，37℃）。將起搏電極置于離體心臟右室，刺激強(qiáng)度設(shè)置為2倍閾強(qiáng)度，頻率為200次／min。將一乳膠水囊（直徑3mm～5mm）經(jīng)左心房置入左心室內(nèi)，水囊內(nèi)充有一定量的灌流液，水囊導(dǎo)管另一端與壓力換能器相連，用量筒收集一定時(shí)間內(nèi)的流出液即為冠脈流量。流量基本穩(wěn)定后，對(duì)左室內(nèi)壓進(jìn)行采集、分析。采用BL－410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)記錄大鼠左室內(nèi)壓上升最大速率（＋dp／dtmax）、左室內(nèi)壓下降最大速率－（dp／dtmax）數(shù)據(jù)。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定 按照試劑盒說明書，實(shí)驗(yàn)主要包括以下步驟。標(biāo)準(zhǔn)品液配制：按照說明書要求配制標(biāo)準(zhǔn)品；加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)血清樣品100μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120min；洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4次～6次，并在濾紙上印干；每孔中加入第一抗體工作液100μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60min，洗板（同前）；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL，將反應(yīng)板置37℃30min后洗板（同前）；每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)15min；每孔加入100μL終止液混勻；30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組不同時(shí)間點(diǎn)之間的比較采用多因素方差分析，采用相關(guān)分析法分析創(chuàng)傷后血清AngⅡ、NE和hs－CRP與離體心功能的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 機(jī)械創(chuàng)傷后24h大鼠離體心功能 與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷組大鼠24h內(nèi)心率、平均動(dòng)脈壓、在體心功能及離體心功能均未見明顯改變（P＞0.05），但創(chuàng)傷后24h離體心功能明顯降低［＋dp／dtmax（5 506±179.7）mmHg／svs（3 455±310.6）mmHg／s，P＜0.01；－dp／dtmax（－3433±335.7）mmHg／svs（－5 205±171.0）mmHg／s，P＜0.01］。

2.2 大鼠機(jī)械創(chuàng)傷后24h內(nèi)血清中AngⅡ濃度（見圖1）偽創(chuàng)組大鼠血清中AngⅡ濃度各時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生明顯變化，因此以偽創(chuàng)組創(chuàng)傷后0h血清AngⅡ濃度為對(duì)照。與偽創(chuàng)組相比，大鼠創(chuàng)傷后6h、12h、24h時(shí)間點(diǎn)血清中AngⅡ濃度升高（P＜0.05或P＜0.01）。

圖1 大鼠創(chuàng)傷后0h、6h、12h、24h血清AngⅡ濃度的變化

2.3 大鼠機(jī)械創(chuàng)傷后24h血清中AngⅡ濃度與離體心功能的相關(guān)性分析 機(jī)械創(chuàng)傷后24h大鼠血清中AngⅡ濃度與左室＋dp／dtmax呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.574，P＜0.05）。

2.4 大鼠機(jī)械創(chuàng)傷后24h內(nèi)血清中腎上腺素濃度 偽創(chuàng)組大鼠血清中腎上腺素濃度各時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生明顯變化，因此以偽創(chuàng)組創(chuàng)傷后0h腎上腺素濃度（10.66±1.54）ng／mL為對(duì)照。與偽創(chuàng)組相比，大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)血清中腎上腺素濃度逐漸上升（P＜0.05）。詳見圖2。

2.5 大鼠機(jī)械創(chuàng)傷后24h血清中腎上腺素濃度與離體心功能的相關(guān)性分析 機(jī)械創(chuàng)傷后24h大鼠血清中腎上腺素濃度與左室＋dp／dtmax呈正相關(guān)（r＝0.402，P＜0.05）。

圖2 大鼠創(chuàng)傷后0h、6h、12h、24h血清腎上腺素濃度的變化

2.6 大鼠機(jī)械創(chuàng)傷后24h內(nèi)血清中hs－CRP濃度 偽創(chuàng)組大鼠血清中hs－CRP濃度各時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生明顯變化，因此以偽創(chuàng)組創(chuàng)傷后0hhs－CRP濃度（3.81±3.19）μg／mL為對(duì)照。與偽創(chuàng)組相比，大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)血清中hs－CRP濃度逐漸上升（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 大鼠創(chuàng)傷后0h、6h、12h、24h血清hs－CRP濃度的變化

2.7 大鼠機(jī)械創(chuàng)傷后24h血清中hs－CRP濃度與離體心功能的相關(guān)性分析 機(jī)械創(chuàng)傷后24h大鼠血清中hs－CRP濃度與左室＋dp／dtmax無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討 論

本研究利用Noble－Collip機(jī)械創(chuàng)傷儀制備機(jī)械創(chuàng)傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，機(jī)械性創(chuàng)傷后24h離體心功能顯著下降，創(chuàng)傷后6 h、12h、24h大鼠血清中NE和hs－CRP濃度均增高；機(jī)械創(chuàng)傷后2 4h大鼠血清中AngⅡ濃度與左室＋dp／dtmax呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.574，P＜0.05），血清中NE濃度與左室＋dp／dtmax呈正相關(guān)（r＝0.402，P＜0.0 5），血清中hs－CRP濃度與左室＋dp／dtmax無關(guān)（P＞0.05）。

本研究參照國內(nèi)外［5，6］及本課題組前期的研究方法［4］制備機(jī)械創(chuàng)傷大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)創(chuàng)組大鼠盡管24h內(nèi)心率、平均動(dòng)脈壓、在體及離體心功能均未出現(xiàn)明顯異常，但創(chuàng)傷后24h離體心功能指標(biāo)＋dp／dtmax和－dp／dtmax顯著降低，提示該創(chuàng)傷模型可以引起遲發(fā)性心功能障礙。關(guān)于機(jī)械創(chuàng)傷致遲發(fā)性心肌損傷的相關(guān)機(jī)制的探討，目前國內(nèi)外研究主要集中在心臟本身的一些病理以及病理生理改變［4，6］，并且創(chuàng)傷所致遲發(fā)性心臟損傷的探討仍處于基礎(chǔ)研究階段，然而根據(jù)臨床報(bào)道，創(chuàng)傷所致的遲發(fā)性心臟損傷在臨床上因其缺乏特異的征象及指標(biāo)而極易漏診。因此，本研究通過制備大鼠機(jī)械創(chuàng)傷模型，觀察創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)情況、炎癥活動(dòng)性等指標(biāo)，篩選出一種可能的血清指標(biāo)，進(jìn)而為創(chuàng)傷后發(fā)生遲發(fā)性心臟功能減退患者的臨床診療提供幫助。

已有的研究認(rèn)為，在體內(nèi)腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS）有非常重要的生理作用，它通過對(duì)心血管系統(tǒng)及腎臟的調(diào)節(jié)來維持血壓、體液、內(nèi)分泌及電解質(zhì)的平衡［7，8］。研究表明，在病理的情況下RAS在被過度激活，通過AngⅡ參與心肌肥大、成纖維細(xì)胞增生等病理過程，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，加速心室重構(gòu)及心力衰竭的發(fā)展［9］，此外，循環(huán)中AngⅡ可以通過收縮血管，促進(jìn)醛固酮和血管加壓素的分泌和交感神經(jīng)介質(zhì)的釋放，加重心臟前后負(fù)荷，增加心肌做功，加速能量消耗和心肌損傷［10］。為了探討機(jī)械創(chuàng)傷致遲發(fā)性心臟功能受損中的可能機(jī)制，觀察了創(chuàng)傷后0h、6h、12h、24h，大鼠血清中AngⅡ濃度的動(dòng)態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后大鼠24h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)血清中AngⅡ的濃度升高，與輕度創(chuàng)傷相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且血清中AngⅡ濃度與左室＋dp／dtmax呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.574，P＜0.05）。這一結(jié)果提示血清AngⅡ濃度與機(jī)械創(chuàng)傷后的遲發(fā)性心功能障礙密切相關(guān)，血清AngⅡ濃度變化有可能作為機(jī)械創(chuàng)傷后發(fā)生遲發(fā)性心功能障礙的血清學(xué)篩選指標(biāo)之一。

眾所周知，藍(lán)斑－交感神經(jīng)－腎上腺髓質(zhì)軸（LC－NE）是應(yīng)激反應(yīng)過程中機(jī)體啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制的重要途徑，在創(chuàng)傷早期代償反應(yīng)中有重要的意義［11］。LC－NE軸主要通過血清中以腎上腺素為主兒茶酚胺發(fā)揮作用，有研究表明，機(jī)體損傷后，血清中腎上腺素濃度升高程度與損傷程度有一定相關(guān)性［12，13］，且血清中腎上腺素濃度變化可作為損傷診斷的輔助指標(biāo)［14］。因此，本研究于創(chuàng)傷后0h、6h、12h、24h，對(duì)偽創(chuàng)組和創(chuàng)傷組大鼠血清中NE濃度進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估各組創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)和損傷程度。檢測(cè)結(jié)果顯示：與偽創(chuàng)傷組相比，創(chuàng)傷后6h、12h、24h大鼠血清中NE濃度明顯升高；血清中NE濃度與左室＋dp／dtmax呈正相關(guān)（r＝0.402，P＜0.05），提示機(jī)械創(chuàng)傷后機(jī)體會(huì)出現(xiàn)一系列非特異性全身應(yīng)激反應(yīng)，血清中的腎上腺素濃度升高。研究表明［15］，機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，腎上腺素起了正性肌力的作用，可以增強(qiáng)心肌收縮力，同時(shí)擴(kuò)張外周骨骼肌的血管，降低心臟后負(fù)荷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，機(jī)械創(chuàng)傷時(shí)血清中腎上腺素濃度升高，左室收縮功能增強(qiáng)，因此認(rèn)為，在創(chuàng)傷早期血清中的腎上腺素可能具有保護(hù)機(jī)體作用。

C反應(yīng)蛋白（CRP）是一種由肝臟產(chǎn)生的急性期反應(yīng)蛋白。正常情況下，CRP僅以微量形式存在，當(dāng)機(jī)體遭受到急性炎癥或創(chuàng)傷等刺激時(shí)，其血清濃度可迅速增加1 000倍以上，是炎癥或組織損傷時(shí)的非特異性標(biāo)志物［16］。最新臨床報(bào)道顯示，通過檢測(cè)血清中CRP濃度可以反映機(jī)體炎癥活動(dòng)性和組織損傷程度［17］。近年來，隨著檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，高靈敏度的檢測(cè)法可檢測(cè)出血清中更低濃度的CRP，稱為hs－CRP，它比CRP更具臨床意義［18］。因此，本研究于創(chuàng)傷后0h、6h、12h、24h，對(duì)創(chuàng)傷組大鼠血清中hs－CRP濃度進(jìn)行評(píng)估炎癥反應(yīng)和損傷程度。檢測(cè)結(jié)果顯示，與偽創(chuàng)組相比，創(chuàng)傷組創(chuàng)傷后血清中hs－CRP濃度均逐步增高，且創(chuàng)傷后24h大鼠血清中hs－CRP濃度與左室＋dp／dtmax無明顯關(guān)（P＞0.05）。從血清中hs－CRP濃度的變化以及hs－CRP濃度與左室＋dp／dtmax相關(guān)性來看，機(jī)械創(chuàng)傷后機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，而hs－CRP與創(chuàng)傷后發(fā)生的遲發(fā)性心功能障礙關(guān)聯(lián)小。

總之，本研究的結(jié)果表明，循環(huán)AngⅡ的過度激活在機(jī)械性創(chuàng)傷導(dǎo)致隨后的心肌損傷或心功能下降發(fā)揮重要作用，強(qiáng)烈提示臨床可以通過檢測(cè)出血液中AngⅡ濃度來作為機(jī)械創(chuàng)傷發(fā)生心功能障礙的篩選指標(biāo)。而腎上腺素可能對(duì)機(jī)械創(chuàng)傷后發(fā)生遲發(fā)性心功能障礙具有正性肌力的作用，但是對(duì)機(jī)械創(chuàng)傷后發(fā)生遲發(fā)性心功能障礙的血清學(xué)篩選作用沒有血清AngⅡ敏感，如果在隨后的實(shí)驗(yàn)中能夠證實(shí)這一假說，將為機(jī)械創(chuàng)傷導(dǎo)致的生命器官繼發(fā)性損傷患者的臨床預(yù)防和治療提供一個(gè)新的思路和靶點(diǎn)。

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