張影 陸堅(jiān) 侯志平 張明霞 陳心春 張興樹 邱振綱

近年來，關(guān)于各種免疫細(xì)胞與肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的研究越來越多，而目前研究較多的是CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞17（helper T cells 17，Th17）。CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟的抑制自身免疫和移植排斥反應(yīng)作用的一群細(xì)胞，約占CD4＋T細(xì)胞總數(shù)的5%～10%，在免疫調(diào)節(jié)過程中主要發(fā)揮抑制作用［1－6］。Th17細(xì)胞屬于CD4＋T細(xì)胞亞群，其通過分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）－17A和IL－17F而發(fā)揮重要的促炎癥作用［7－12］。目前，其與結(jié)核病之間關(guān)系的研究已成為近年的熱點(diǎn)，有研究顯示，Th17細(xì)胞是IL－17的主要來源細(xì)胞，而且參與抗結(jié)核的保護(hù)性免疫反應(yīng)過程［13－16］。CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞作為兩組在結(jié)核性免疫過程中發(fā)揮重要作用的免疫細(xì)胞，各自在結(jié)核免疫反應(yīng)中作用的研究均較多，但對于兩組細(xì)胞在抗結(jié)核治療過程中的相互作用及其相應(yīng)動態(tài)變化的研究報(bào)道較少。為此，筆者就抗結(jié)核治療中兩組細(xì)胞的相互變化情況進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料和方法

一、患者來源和標(biāo)本

分為肺結(jié)核患者組，健康對照組和結(jié)核潛伏感染組共3個組。肺結(jié)核患者組32例，均為來自深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院2011年1月至2011年6月門診收治的痰抗酸桿菌（acid－fast bacilli，AFB）涂片陽性的新發(fā)肺結(jié)核患者，其中男20例，女12例，年齡16～59歲，平均年齡（33．5±10．3）歲，隨訪抗結(jié)核治療后3個月、6個月；所有肺結(jié)核患者均經(jīng)臨床癥狀、體征、X線胸片、痰抗酸桿菌涂片、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果確定，并且菌種鑒定均為結(jié)核分枝桿菌。門診收治患者一旦發(fā)現(xiàn)痰涂片結(jié)果顯示陽性，且無涉及排除標(biāo)準(zhǔn)中任何一條，即考慮入組，待患者痰分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果明確為結(jié)核分枝桿菌感染，即算是完全符合條件入組，如痰分枝桿菌培養(yǎng)陰性，或不是結(jié)核分枝桿菌感染則排除。

對照組包括健康對照組和結(jié)核潛伏感染組。納入標(biāo)準(zhǔn)為：健康對照組45例，男25例，女20例，年齡20～49歲，平均年齡（35．5±10．1）歲，健康對照組為廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳第三醫(yī)院2011年1月至2011年3月體檢科健康體檢者，所有健康者均無咳嗽、咯痰、發(fā)熱等相關(guān)癥狀，X線胸片無異常，經(jīng)我院自行研制結(jié)核酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測提示結(jié)核分枝桿菌陰性；結(jié)核潛伏感染組25例，男13例，女12例，年齡25～52歲，平均年齡（36．2±9．9）歲。結(jié)核潛伏感染者為廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳第三醫(yī)院2011年1月至2011年3月體檢科健康體檢者，所有潛伏感染者均無咳嗽、咯痰、發(fā)熱等相關(guān)癥狀，X線胸片無異常，但經(jīng)我院自行研制的結(jié)核酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測提示結(jié)核分枝桿菌陽性。

所有研究對象均排除乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、HIV等病毒感染；排除其他慢性疾病如糖尿病、高血壓、腎炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾?。凰薪Y(jié)核病患者在入組前均未接受過抗結(jié)核治療。所有研究對象均采集肝素鋰抗凝的靜脈血5ml。具體程序經(jīng)深圳第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，患者及志愿者均簽署知情同意書。

本實(shí)驗(yàn)在入組結(jié)束后已對三組入組者的性別進(jìn)行卡方檢驗(yàn)、年齡進(jìn)行方差分析，提示差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

二、檢測方法

（一）主要設(shè)備和試劑

1．設(shè)備：流式細(xì)胞儀為美國BD公司生產(chǎn)，型號為BD Canto流式細(xì)胞儀。CO2培養(yǎng)箱購自日本三洋電機(jī)公司。

2．試劑：單克隆抗體 CD3－PerCP－Cy5．5（產(chǎn)品編號555334）、CD4－PerCP－Cy5．5（產(chǎn)品編號555348）、CD25－FITC（產(chǎn)品編號347643）、CD127－APC（產(chǎn)品編號558598）均購自美國BD公司。單克隆抗體CD3－APC－Cy7（產(chǎn)品編號 344818）、CD8－APC－Cy7（產(chǎn)品編號301016）、IL－17－PE（產(chǎn)品編號512306）均購自美國BioLegend公司。RPMI 1640培養(yǎng)基［含100mg／L鏈霉素、1×105U／L盤尼西林、10%胎牛血清（澳大利亞Invitrogen公司）、5×10－5mol／L 2－巰基乙醇］購自美國GIBCO公司。刺激物佛波酯（propylene glycol monomethyl ether acetate，PMA）、離子霉素（ionomycin）、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（brefeldin A，BFA）均購自美國 Sigma－Aldrich公司。溶 血 素 （FACS lysing solution）及 破 膜 劑（FACS permeabilizing solution）均購自 BD Biosciences公司。密度梯度分離液LymphoprepTM1．077購自挪威Axis－Shield公司。

表1 三組入組者的性別年齡的比較

（二）流式細(xì)胞術(shù)分析

1．Th17細(xì)胞檢測：分別取45名健康志愿者、25例潛伏感染者肝素鋰抗凝全血250μl，32例活動性肺結(jié)核患者治療前及其治療3個月、6個月肝素鋰抗凝全血250μl，與750μl含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基充分混勻，共1ml，此培養(yǎng)體系中加入刺激物PMA、離子霉素終濃度分別為（50ng／ml、1μg／ml），振蕩混勻后于CO2培養(yǎng)箱，37℃孵育。1h后，在培養(yǎng)體系中加入阻斷因子BFA（終濃度10μg／ml），繼續(xù)CO2培養(yǎng)箱37℃孵育5h。常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞表面 CD3－PerCP－Cy5．5、CD8－APC－Cy7、溶血素、破膜劑、細(xì)胞內(nèi)IL－17－PE因子染色（IL－17為Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，因此檢測IL－17分泌量即可反映Th17細(xì)胞量）。具體操作均參照各抗體說明書執(zhí)行。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色結(jié)果分析。在淋巴細(xì)胞設(shè)門分析CD3＋CD8－細(xì)胞（即CD3＋CD4＋細(xì)胞）表達(dá)情況，然后在CD3＋CD4＋細(xì)胞設(shè)門分析IL－17細(xì)胞因子所占CD3＋CD4＋T細(xì)胞的百分率（圖1）。

2．CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測：分別取45名健康志愿者、25例潛伏感染者肝素鋰抗凝血4ml，32例活動性肺結(jié)核患者治療前及其治療3個月、6個月肝素鋰抗凝血4ml，使用LymphoprepTM1．077密度梯度分離液經(jīng)密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC），取2×105個單個核細(xì)胞，加入 APC－Cy7 標(biāo)記的 CD3、PerCPCy5．5標(biāo)記的CD4、FITC標(biāo)記的CD25、APC標(biāo)記的CD127抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色，具體操作均參照各抗體說明書執(zhí)行。采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色結(jié)果分析。在淋巴細(xì)胞設(shè)門分析CD3、CD4細(xì)胞表達(dá)情況，然后在CD4細(xì)胞設(shè)門分析CD25＋CD127low細(xì)胞所占CD3＋CD4＋T細(xì)胞的百分率（圖2）。

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

圖1 肺結(jié)核患者外周血IL－17表達(dá)散點(diǎn)圖

圖2 肺結(jié)核患者外周血CD4＋CD25＋CD127low T細(xì)胞表達(dá)散點(diǎn)圖

1．肺結(jié)核患者組外周血IL－17表達(dá)情況：肺結(jié)核患者組非特異性IL－17表達(dá)為（3．25±1．68）%，較健康對照組［（4．62±1．46）%］明顯較低（F＝6．633，P＜0．0001），與 潛 伏 感 染 者 ［（4．12±1．82）%］比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺結(jié)核患者隨治療時間的延長，IL－17逐漸增加，治療6個月［（5．58±1．66）%］較治療前［（3．25±1．68）%］及治療3個月［（4．17±2．27）%］明顯增加（F＝12．244，P＜0．0001和P＝0．004）。治療3個月與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝12．244，P＝0．057），治療6個月高于健康對照組（t＝2．671，P＝0．0093）（表2，3）。

表2 治療前各組外周血IL－17及CD4＋CD25＋CD127low T細(xì)胞表達(dá)情況

表3 肺結(jié)核患者組療程中外周血IL－17及CD4＋CD25＋CD127low T細(xì)胞表達(dá)情況

2．肺結(jié)核患者組外周血CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)情況：肺結(jié)核患者組外周血CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)為（6．59±1．73）%，較健康對照組［（4．97±1．60）%］及結(jié)核潛伏感染組［（5．00±1．08）%］明顯偏高（F＝11．986，P值均＜0．0001）。健康對照組與結(jié)核潛伏感染組的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝11．986，P＝0．937）。肺結(jié)核患者組抗結(jié)核治療3個月CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平為（8．28±2．04）%，較治療前（6．59±1．73）%明顯增加（F＝6．458，P＝0．001）；治療6個月CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為（7．46±1．87）%，與治療前及治療3個月比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6．458，P＝0．068和P＝0．085），但仍較健康對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6．255，P＜0．0001）（表2，4）。

表4 各組治療6個月外周血IL－17及CD4＋CD25＋CD127low T細(xì)胞表達(dá)情況

討 論

Th17在結(jié)核感染中發(fā)揮的保護(hù)性細(xì)胞免疫不容忽視。Th17細(xì)胞屬于CD4＋T細(xì)胞亞群，但是不同于Th1和Th2細(xì)胞群。Th17細(xì)胞通過產(chǎn)生的IL－17與靶細(xì)胞的IL－17受體（IL－17R）結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)的功能，可以有效地介導(dǎo)病變組織的炎癥反應(yīng)［17－19］。研究表明，人體感染結(jié)核分枝桿菌后可以誘導(dǎo)抗原特異性Th17細(xì)胞反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)與單純結(jié)核分枝桿菌暴露者相比，活動性肺結(jié)核患者體內(nèi)Th17細(xì)胞減少。并有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌非特異性Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)也被抑制，而且Th17細(xì)胞減少的數(shù)量與結(jié)核感染嚴(yán)重程度呈正比［17］。

同樣，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在結(jié)核免疫中的作用也很重要。研究發(fā)現(xiàn)CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過上調(diào)表達(dá)FoxP3（forkhead box P3）來發(fā)揮免疫抑制功能［20］，但是FoxP3的檢測操作復(fù)雜，需要破細(xì)胞核核膜操作，不宜常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞功能的研究［21］。另有研究表明CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中低表達(dá)CD127，CD4＋CD25＋CD127low被認(rèn)為是一種更為理想的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面分子標(biāo)志［22］。機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌的免疫主要是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后不僅與結(jié)核分枝桿菌感染的數(shù)量和毒力有關(guān)，與宿主的細(xì)胞免疫功能也有著密切的關(guān)系。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能顯著抑制PBMC和CD4＋CD25－T細(xì)胞對BCG的增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子的分泌［20］，其通過抑制Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致Th1細(xì)胞因子如IFN－γ、IL－2分泌的減少，削弱機(jī)體免疫系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌的清除能力，使結(jié)核分枝桿菌感染慢性化。同時CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也可抑制過強(qiáng)的Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而避免機(jī)體的免疫病理損害［23］。

本研究通過對45名健康對照者、25例結(jié)核潛伏感染者、32例肺結(jié)核患者及其結(jié)核治療隨訪過程的外周血標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者組外周血非特異性Th17細(xì)胞因子IL－17的表達(dá)較健康對照組及結(jié)核潛伏感染組明顯降低，說明結(jié)核分枝桿菌感染后，機(jī)體Th17細(xì)胞應(yīng)答明顯受到抑制，不能產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)。經(jīng)治療后，結(jié)核病患者外周血IL－17明顯升高，并較健康對照組高。32例肺結(jié)核患者治療3個月抗酸染色涂片及痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均陰性，治療6個月X線胸片結(jié)核病灶均表現(xiàn)為明顯吸收，其中3例患者胸部X線片表現(xiàn)為完全吸收，IL－17的表達(dá)與32例患者臨床轉(zhuǎn)歸表現(xiàn)出良好地一致性（因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)沒有做患者轉(zhuǎn)歸的CT評分，僅僅用X胸片及痰抗酸染色涂片及痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果來表達(dá)轉(zhuǎn)歸情況，所以就沒有在結(jié)果中用表格再次表達(dá)出來，僅在此處提及）。

本研究中，肺結(jié)核患者組CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)明顯高于健康對照組及結(jié)核潛伏感染組，雖然CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在治療3個月仍有進(jìn)一步升高，可能由于短期抗結(jié)核治療后大量結(jié)核分枝桿菌釋放而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生免疫抑制現(xiàn)象，但隨著有效的抗結(jié)核治療的進(jìn)行，機(jī)體免疫系統(tǒng)功能逐漸恢復(fù)，6個月后，CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較治療3個月呈下降趨勢，雖然尚未下降至健康者水平，但通過對本研究入組結(jié)核病患者CD3、CD4、CD8細(xì)胞的隨訪發(fā)現(xiàn)，雖然結(jié)核病患者治療過程中CD3、CD4、CD8陽性細(xì)胞均有不同程度升高，但并未升至正常水平。CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過上調(diào)表達(dá)FoxP3來發(fā)揮免疫抑制功能，而Th17細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子IL－17A和IL－17F而發(fā)揮顯著促炎癥作用。關(guān)于Th17抑制與CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的關(guān)系，目前認(rèn)為兩者互為拮抗，在Th17及CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化過程均要通過轉(zhuǎn)化生長因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β），另 外 CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3通過直接與視黃酸相關(guān)的孤兒核受體（retinoic acid－related orphan receptor gamma t，RORγt）結(jié)合而抑制RORγt介導(dǎo) IL－17AmRNA 的轉(zhuǎn)錄，從 而 影 響Th17細(xì)胞的功能［24］。筆者也通過隨訪也發(fā)現(xiàn)增高的CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17抑制相一致，符合目前文獻(xiàn)報(bào)道。

綜上所述，抗結(jié)核治療過程中Th17的升高伴CD4＋CD25＋CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞下降，說明兩者在結(jié)核免疫中均發(fā)揮重要作用，提示兩者可作為今后抗結(jié)核治療療效考核的依據(jù)。

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