雷青娟，高保嬌，張正國(guó)，姜桂明

(中北大學(xué) 化學(xué)工程系，山西 太原 030051)

酶的固定化是近幾十年來(lái)生物技術(shù)領(lǐng)域中最為矚目的進(jìn)展之一。這一技術(shù)既克服了游離酶催化過(guò)程中酶催化劑與底物及產(chǎn)物難以分離的缺點(diǎn)，又可使酶催化劑重復(fù)利用，極大地提高了酶催化的效率與穩(wěn)定性［1～3］，因此關(guān)于酶的固定化一直是生物界與化學(xué)界廣泛關(guān)注的課題。

含有環(huán)氧基團(tuán)的載體，其表面的環(huán)氧基團(tuán)與蛋白質(zhì)大分子鏈上的多種基團(tuán)(氨基、巰基、酚羥基等)均很容易發(fā)生反應(yīng)，無(wú)需任何鏈接分子即可與生物大分子形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。因此，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)室的研究還是工業(yè)規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用，含有環(huán)氧基團(tuán)的聚合物微球都是共價(jià)結(jié)合法固酶的較為理想的載體［4，5］。甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)是含有環(huán)氧基團(tuán)的單體，通過(guò)均聚或共聚制備的交聯(lián)聚合物微球，經(jīng)常被用作酶固定化載體［6～8］。

雖然環(huán)氧載體是固酶的一種良好載體，但在一般條件下實(shí)施酶的固定化時(shí)。由于環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)活性不夠高［9，10］，得不到高的固酶效率。研究者們?cè)谳d體表面引入對(duì)酶蛋白具有親和作用的第二功能基團(tuán)，形成雙功能載體，以提高固酶效率。

本文以偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)劑，γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)為偶聯(lián)劑，采用“接出”法將甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)接枝于微米級(jí)硅膠(SiO2)微粒表面制得接枝微粒PGMA/SiO2(1);以乙二胺(EDA)為功能單體，對(duì)1進(jìn)行改性，在EDA表面引入胺基制得雙功能復(fù)合載體EDA-PGMA/SiO2(2，Scheme 1)。對(duì)接枝聚合的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，并初步考察了2對(duì)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的固定性能。結(jié)果表明，2能顯著地提高HRP的固定化效率，對(duì)于采用共價(jià)偶聯(lián)法實(shí)現(xiàn)酶的高效固定化具有一定的參考價(jià)值。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1700型傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片);Zetasizer Nano-Z型Zeta電位分析儀;721型分光光度計(jì)。

硅膠(120目～160目)，試劑級(jí)，青島海洋化工有限公司;MPS，分析純，南京曙光化工集團(tuán)有限公司;GMA，分析純，蘇州南航化工有限公司，用前減壓蒸餾提純;AIBN，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);EDA，分析純，天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng);辣根過(guò)氧化物酶(HRP，250 U·mg-1，等電點(diǎn)在pH 8.0附近)，生化試劑，上海雪滿(mǎn)生物技術(shù)有限公司;其余所用試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 制備

(1)1制備

將硅膠30 g置于5%甲烷磺酸溶液中，攪拌下于90℃活化8 h。抽濾，濾餅用蒸餾水洗滌，真空干燥制得活化硅膠(A)。

在50%乙醇100 mL中加入A 10 g和單體MPS 10 mL，攪拌下于50℃反應(yīng)24 h。抽濾，濾餅用乙醇洗滌，真空干燥得經(jīng)KH-570表面改性的硅膠微粒MPS/SiO2。

在四口燒瓶中加入 MPS/SiO21.5 g，DMF 100 mL和單體GMA 5 mL，通氮?dú)?0 min以排除體系中的空氣。升溫至70℃，加入引發(fā)劑AIBN(w=1.4 wt%，占單體GMA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，攪拌下于70℃接枝聚合反應(yīng)20 h。抽濾，濾餅置索氏抽提器中，用丙酮抽提24 h以除去物理吸附在微粒表面的聚合物。取出，真空干燥制得白色固體1，采用鹽酸-丙酮法［11］測(cè)定1表面上的PGMA的接枝度(GD)。

(2)2的制備

在四口燒瓶中加入1 2 g和DMSO 40 mL，浸泡溶脹12 h。加蒸餾水40 mL，用20%NaOH溶液調(diào)至pH 11.0;加入 EDA 40 mL，攪拌下于80℃反應(yīng)一定時(shí)間。過(guò)濾，濾餅用蒸餾水反復(fù)洗滌除去未反應(yīng)的EDA，經(jīng)真空干燥得白色固體2。

采用重量法按下式計(jì)算接枝PGMA環(huán)氧基團(tuán)的開(kāi)環(huán)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，即EDA的鍵合率(BR)。

式中:m1(g)為1的質(zhì)量，m2(g)為2的質(zhì)量;M'(60.1)為n(2)-n(1);GD(g·100 g-1)為1的接枝度;M(142.15)為接枝PGMA的鏈節(jié)摩爾質(zhì)量

1.3 2對(duì)HRP的固定化性能測(cè)定

在錐形瓶中加入2 0.5 g和0.1 g·L-1HRP(pH 8.5)10 mL，于25℃恒溫振蕩一定時(shí)間進(jìn)行酶的固定化制得固定化酶。以偶聯(lián)率(CR)表示2對(duì)HRP的固定化效果。HRP的活力采用沃辛通法［12］測(cè)定，利用所測(cè)得的原酶溶液活力(E0/U·mL-1·min-1)與固定化后殘余酶活力(Ef/U·mL-1·min-1)數(shù)據(jù)計(jì)算HRP的CR［CR=(E0-Ef)/E0×100%］。

用電位分析儀在不同pH條件下測(cè)定2的ζ電位，繪制ζ電位曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征

1和2的IR譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，在1的IR譜圖中顯示出接枝聚合物PGMA的特征吸收(酯羰基的伸縮振動(dòng)吸收峰位于1 732 cm-1處，環(huán)氧鍵的特征振動(dòng)吸收峰位于905 cm-1處)。從2的IR譜可見(jiàn)，1 567 cm-1附近出現(xiàn)了伯氨基鍵(C-N)的吸收峰，同時(shí)，在905 cm-1處環(huán)氧鍵的特征振動(dòng)基本消失。譜峰的變化充分表明，通過(guò)接枝PGMA大分子鏈中環(huán)氧鍵的開(kāi)環(huán)反應(yīng)，EDA已經(jīng)鍵合在接枝微粒1上，形成了雙復(fù)合載體2。需要說(shuō)明的是，受SiO2強(qiáng)吸收背景的影響，兩種微粒的諸特征吸收都顯得很弱。

圖1 1和2的IR譜圖Figure 1 IR spectra of 1 and 2

2.2 接枝聚合的影響因素

采用接枝度為指標(biāo)來(lái)考察諸因素對(duì)接枝聚合的影響。于70℃反應(yīng)20 h，其余反應(yīng)條件同1.2(2)，考察諸因素對(duì)接枝聚合的影響，以尋找最佳的聚合條件。

(1)引發(fā)劑用量［w(AIBN)］對(duì)接枝度的影響

改變引發(fā)劑用量，其余反應(yīng)條件同1.2(1)，考察w(AIBN)對(duì)接枝度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可看到，隨著w(AIBN)的增加，接枝度呈現(xiàn)先增大后減小的變化規(guī)律，w(AIBN)=1.4 wt%時(shí)，具有最大的接枝度(17.48 g·100 g-1)。這是因?yàn)橐l(fā)劑用量過(guò)大時(shí)，接枝聚合反應(yīng)的速率過(guò)快，且接枝聚合物的分子量低，在短時(shí)間內(nèi)形成致密的阻隔層，阻止接枝聚合繼續(xù)進(jìn)行，故使接枝度降低。最佳的w(AIBN)=1.4 wt%。

圖2 w(AIBN)對(duì)接枝度的影響*Figure 2 Effect of w(AIBN)on grafting degree

(2)單體用量［V(GMA)］對(duì)接枝度的影響

w(AIBN)=1.4 wt%，其余反應(yīng)條件同 1.2(1)，改變單體(GMA)用量，考察其對(duì)接枝聚合的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看到，PGMA的接枝度隨單體用量的增大而增加，但GMA達(dá)11 mL后，接枝度幾乎不再變化(最大為23.55 g·100 g-1)。這是因?yàn)殡S著單體用量的增大，接枝聚合反應(yīng)的速率會(huì)顯著加快，且有利于生成高分子量的接枝聚合物，接枝率會(huì)明顯增大;當(dāng)單體用量增大到一定值時(shí)，接枝率達(dá)最大值，再增大單體量，由于接枝聚合反應(yīng)的速率過(guò)快，在較短時(shí)間內(nèi)硅膠表面就會(huì)迅速形成致密的聚合物覆蓋層，抑制了接枝聚合反應(yīng)進(jìn)行。最佳GMA用量為11 mL。

圖3 GMA用量對(duì)接枝率的影響*Figure 3 Effect of GMA amount on grafting degree

綜上所述，接枝聚合的最佳反應(yīng)條件為:w(AIBN)=1.4 wt%，GMA為11 mL，于70℃反應(yīng)20 h，1 的接枝度為 23.55 g·100 g-1。

2.3 RDA的鍵合率的變化

圖4為EDA的鍵合率隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)。從圖4中可看出，在開(kāi)始階段，EDA的鍵合率隨反應(yīng)時(shí)間而迅速增大;當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到約8 h后，EDA的鍵合率的增大開(kāi)始趨于緩慢;再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，EDA的鍵合率甚至不再改變。其原因在于:當(dāng)1表面的 EDA鍵合量足夠高時(shí)，以鍵合EDA的端伯胺基為反應(yīng)基團(tuán)，接枝大分子鏈之間的交聯(lián)反應(yīng)(環(huán)氧基團(tuán)的開(kāi)環(huán))將逐漸變?yōu)橹鲗?dǎo)反應(yīng)，而EDA的鍵合反應(yīng)則受到抑制，導(dǎo)致EDA的鍵合量趨于一定值。本研究將反應(yīng)時(shí)間控制在0～8 h，制得EDA的鍵合率在7%～60%內(nèi)變化的載體微粒2。

圖4 EDA鍵合率隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)*Figure 4 Variation curve of bonding rate of EDA with reaction time

2.4 表面電性能

圖5為1和2的ζ電位隨介質(zhì)pH的變化曲線(xiàn)，即它們的ζ電位曲線(xiàn)。從圖5可清楚地看到，在較大的pH范圍內(nèi)，1的ζ電位幾乎為零(稍顯負(fù)值)，即微粒表面不帶電荷;在較大的pH范圍內(nèi)，2的ζ電位卻為絕對(duì)值較大的正值，意味著表面帶有高密度的正電荷。這是由于鍵合在其表面的EDA的胺基，在水介質(zhì)中會(huì)發(fā)生質(zhì)子化作用，使微粒表面帶上了正電荷。

圖5 1和2的ζ電位曲線(xiàn)Figure 5 Zeta potential curves of 1 and 2

2.5 2固定HRP的特性

在pH 8.5的條件下，使用EDA鍵合率不同的功能載體2對(duì)HRP進(jìn)行了固定化，制得了多種固定化酶，即得不同偶聯(lián)率的2。圖6給出了HRP在不同載體上的偶聯(lián)率隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)。從圖6中可以清楚地看到:對(duì)于EDA鍵合率不同的載體，在4 h內(nèi)，HRP的偶聯(lián)率均達(dá)到最高值，表明4 h為適宜的固定化時(shí)間。在pH 8.5的條件下實(shí)施HRP的固定化時(shí)，HRP的偶聯(lián)率隨載體表面EDA鍵合率的不同而產(chǎn)生差別;當(dāng)乙二胺鍵合率較低時(shí)，HRP的偶聯(lián)率隨載體表面EDA鍵合率增大而提高;當(dāng) EDA鍵合率為31.08%(即在30%附近)時(shí)，HRP的偶聯(lián)率具有最高值(57.85%);當(dāng)EDA鍵合率繼續(xù)增大時(shí)，偶聯(lián)率轉(zhuǎn)而下降。

圖6 EDA鍵合不同載體時(shí)固定化酶的偶聯(lián)率隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)*Figure 6 Variation curves of HRP coupling rate with time as using carriers with different EDA bonding rates

采用共價(jià)偶聯(lián)法實(shí)現(xiàn)酶的固定化，一般要經(jīng)歷物理吸附與化學(xué)鍵合兩個(gè)過(guò)程。本研究所用的HRP，其等電點(diǎn)為 8.0，故在 pH 8.5 的條件下HRP蛋白分子帶有負(fù)電荷，而功能載體2表面帶有正電荷(圖5)。顯然，兩者之間會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電相互作用;而且，2表面EFDA鍵合率越高，質(zhì)子化的胺基密度越高，兩者之間的靜電相互作用越強(qiáng);因此，EDA鍵合率高的載體將會(huì)將大量的HRP蛋白分子吸附致其表面，進(jìn)而發(fā)生化學(xué)鍵合，充分發(fā)揮雙功能作用，導(dǎo)致高的酶偶聯(lián)率。至于當(dāng)EDA鍵合率超過(guò)30%后偶聯(lián)率與比活力又呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其原因可能是:EDA鍵合率過(guò)高時(shí)，由于環(huán)氧基團(tuán)的過(guò)多消耗，使表面存留的環(huán)氧基團(tuán)減少，影響了酶蛋白的化學(xué)鍵合，使固定化酶的偶聯(lián)率。

3 結(jié)論

(1)采用“接出”法，將GMA接枝在微米級(jí)硅膠微粒表面制備了接枝微粒PGMA/SiO2，乙二胺與接枝PGMA的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)，將乙二胺基團(tuán)引入接枝微粒表面，形成了雙功能復(fù)合載體EDA-PGMA/SiO2。

(2)采用共價(jià)偶聯(lián)法實(shí)施了辣根過(guò)氧化酶的固定化，復(fù)合載體EDA-PGMA/SiO2結(jié)合了硅膠微粒優(yōu)良的物理化學(xué)性能，是固定化辣根過(guò)氧化酶的良好載體。更重要的是該復(fù)合載體與辣根過(guò)氧化酶蛋白之間的靜電相互作用，對(duì)酶的固定化可產(chǎn)生顯著的促進(jìn)作用，有效提高固定化酶的偶聯(lián)率。

［1］ Katchalski-Katzir E，Kraemer D M，Eupergit C.A carrier for immobilization of enzymes of industrial potential［J］.Journal Molecular Catalysis B:Enzymatic，2000，10(1-3):157-176.

［2］ Maria C A S，Zhao X S.Design of large-pore mesoporous materials for immobilization of penicillin G acylase biocatalyst［J］.Catalysis Today，2004，(93-95):293-299.

［3］ Betancor L，Hidalgo A，Lorente G F，et al.Use of physicochemical tools to determine the choice of optimal enzyme:Stabilization of amino acid oxidase［J］.Biotechnology Progress，2003，19(3):784-788.

［4］ Bayramo?lu G，Akg?l S，Bulut A，et al.Covalent immobilization of invertase onto a reactive film composed of 2-hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate:Properties and application in a continuous flow system［J］.Biochemical Engineering Journal，2003，14(2):117-126.

［5］ Arica M Y，Bayramo?lu G，Bl?ak N.Characterisation of tyrosinase Immobilised onto spacer-arm attached glycidyl methacry-based reactive microbesda［J］.Process Biochemistry，2004，39(12):2007-2017.

［6］ Hou X H，Liu B L，Deng X B，et al.Covalent immobilization of glucose oxidase onto poly(styrene-co-glycidyl methacrylate)monodisperse fluorescent microspheres synthesized by dispersion polymerization［J］.Analytical Biochemistry，2007，(368):100-110.

［7］ Mileti?N，Vukovi? Z，Nastasovi? A，et al.Macroporous poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate)resins-versatile immobilization supports for biocatalysts［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2009，56(4):196-201.

［8］ Kartal F，Akkaya A，Kilinc A.Immobilization of porcine pancreatic lipase on glycidyl methacrylate grafted poly vinyl alcohol［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2009，57(1):55-61.

［9］ Chen C I，Chen C W，Huang C W，et al.Simultaneous purification and immobilization of penicillin g acylase using bifunctional membrane［J］.Journal of Membrane Science，2007，298(1-2):24-29.

［10］ Mateo C，Torres R，F(xiàn)L G，et al.Epoxy-amino groups:A new tool for improved immobilization of proteins by the epoxy method［J］.Biomacromolecules，2003，4:772-777.

［11］ Sun Min，Qiu Hong-deng，Wang Li-cheng，et al.Poly(1-allylimidazole)-grafted silica，a new specific stationary phase for reversed-phase and anion-exchange liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2009，(1216):3904-3909.

［12］ Nicell J A，Wright H.A model of peroxidase activity with inhibition by hydrogen peroxide［J］.Enzyme and Microbial Technology，1997，21(9):302-310.