張 萍，王仲孚，黃琳娟

(1.咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000;2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

糖類物質(zhì)的研究已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。天然糖類物質(zhì)本身極性較大、沒有發(fā)光基團(tuán)，無法直接運(yùn)用紫外或熒光檢測技術(shù)進(jìn)行分析，加之糖類物質(zhì)的離子化效率較低，對微量組分來說，目前的質(zhì)譜檢測技術(shù)也無法滿足靈敏度要求。因此，糖鏈的衍生化技術(shù)已成為近年來研究的熱點(diǎn)之一。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)屬于 1，3-取代的吡唑啉酮類試劑，其4-C具有較高的負(fù)電性，可以發(fā)生親核反應(yīng)。該類試劑在醫(yī)藥行業(yè)中可作為腦自由基清除劑以治療急性腦梗塞［1～3］。1989年，Honda等［4］首次使用PMP在堿性環(huán)境下標(biāo)記還原糖，并實(shí)現(xiàn)糖鏈衍生物的反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離。之后PMP作為一種糖類物質(zhì)的衍生化試劑不斷被推廣應(yīng)用，衍生化條件也不斷被改善。由于PMP衍生物表現(xiàn)出良好的色譜、質(zhì)譜分析檢測性能，并且衍生化條件溫和，和廣泛使用的還原氨化試劑相比，不會(huì)引起糖基化丟失現(xiàn)象，在寡糖的單糖組成分析、糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)分析等方面已廣泛使用［5］。但目前還存在兩個(gè)主要問題需要解決:一是缺乏商品化PMP同位素試劑，使其在糖鏈的同位素標(biāo)記-質(zhì)譜相對定量分析方面的應(yīng)用目前仍屬空白;二是PMP試劑疏水性偏低，衍生物穩(wěn)定性不理想，且類似物種類少，無法滿足當(dāng)前種類復(fù)雜的糖類物質(zhì)分析檢測的需要。因此，對氘代-PMP及其類似物即1，3-取代吡唑啉酮類試劑的合成研究具有重要意義。

傳統(tǒng)的吡唑啉酮類化合物的合成一般是將含β-羰基的酯類化合物與肼類衍生物在酸性條件下加熱反應(yīng)合成［6～8］。近年來發(fā)展的合成工藝有:固相合成［9］、微波輻射合成［10］以及超聲介導(dǎo)的無溶劑合成［3］等技術(shù)。

本文以合成產(chǎn)率高、工藝簡單以及成本低廉為目的，對1，3-取代的吡唑啉酮化合物的合成工藝進(jìn)行了改進(jìn)，采用冰醋酸催化的無溶劑合成法合成了 1-五氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(d5-PMP)及其類似物1，3-二苯基-5-吡唑啉酮(DPP)和1-(4-異丙苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(PPMP)(Scheme 1)，其中d5-PMP和PPMP為新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV，1H NMR，13C NMR，MS及元素表征。并通過ESI-MS對d5-PMP，DPP及PPMP與乳糖的衍生化性能進(jìn)行了初步研究。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV254型紫外分析儀;Perkin Elmer Lambda 25型紫外可見分光光度計(jì);Varian-400型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));LTQ-XL型質(zhì)譜儀;Vario ELⅢ型元素分析儀。

d5-苯肼按文獻(xiàn)［11］方法合成;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(d0-PMP)，Sigma-Aldrich公司;d5-苯胺，4-異丙基苯肼鹽酸鹽(98%)和苯肼，Sigma-Aldrich公司;乙酰乙酸乙酯和苯甲酰乙酸乙酯，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;薄層硅膠板UV254，德國MACHEREY-NAGEL公司;其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 合成

(1)d5-PMP的合成

在反應(yīng)瓶中加入d5-苯肼8.76 g(77 mmol)，攪拌下依次滴加冰乙酸1.0 mL和乙酰乙酸乙酯9.8 mL(77 mmol)，滴畢，于25℃～30℃反應(yīng)5 h［TLC檢測，展開劑:A=V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3 ∶2，對照品 d0-PMP］。加 CH2Cl250 mL，攪拌均勻后，于40℃減壓抽干得黏稠狀粗品，經(jīng)硅膠柱層析［石油醚濕法裝柱(5.8 cm×25 cm)并平衡，粗品用少量甲醇溶解后，加入硅膠拌勻，揮干甲醇后上柱，洗脫劑:V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=6∶1，對照品 d0-PMP］純化，收集含 d5-PMP的流出液，于35℃減壓蒸除溶劑得淺黃色粉末 d5-PMP 8.5 g，收率 61.68%，純度 99.30%(HPLC)，m.p.124℃～127℃;UV-Vis(EtOH):λmax=247 nm;1H NMR δ:2.19(s，3H，CH3)，3.45(s，2H，CH2);13C δ:16.98(CH3)，43.04(CH2)，118.34(N=C)，128.50，137.82，156.28，170.50(C=O);ESI-MS m/z:180.3{［M+H］+};Anal.calcd for C10H5N2OD5:C 67.03，H 2.81，N 15.62，D 5.62;found C 67.07，H 2.79，N 15.69，D 5.56。

(2)DPP的合成

在反應(yīng)瓶中加入苯肼5.5 g(50 mmol)，攪拌下于室溫依次滴加苯甲酰乙酸乙酯9.0 mL(50 mmol)和冰乙酸1.0 mL，滴畢，于室溫反應(yīng) 30 min，生成大量白色乳狀固體，繼續(xù)碾磨反應(yīng)2 h(TLC檢測，二氯甲烷為展開劑)。固體用少量正己烷洗滌，用乙醇重結(jié)晶得白色粉末DPP 4.418 g，收率 93.6%，純度 99.5%(HPLC)，m.p.136℃～137℃;UV-Vis(EtOH):λmax=270 nm;1H NMR δ:3.87(s，2H，CH2)，7.23，7.46(AA'XX'，4H，N-PhH)，7.79，7.97(AA'XX'，4H，CPhH);13C NMR δ:39.64(CH2)，119.04(N=C)，125.29，125.95，128.85，128.90，130.70，130.80(CH in Ph)，138.06，154.62(C in Ph)，170.21(C=O);ESI-MS m/z:237.3{［M+H］+};Anal.calcd for C15H12N2O:C 76.27，H 5.12，N 11.85;found C 76.21，H 5.17，N 11.82。

(3)PPMP的合成

在反應(yīng)瓶中加入4-異丙基苯肼鹽酸鹽3.734 g(20 mmol)，攪拌下滴加5%NaOH溶液17 mL，滴畢，于30℃反應(yīng)4 h;用1 mol·L-1鹽酸中和至pH 8～9，用二氯甲烷萃取至在紫外燈下無明顯熒光斑點(diǎn)。合并二氯甲烷，蒸干得淺黃色固體4-異丙基苯肼(2.90 g，收率 96.76%)。加乙酰乙酸乙酯2.5 mL和冰乙酸1.0 mL，于室溫反應(yīng)6 h(TLC檢測，展開劑:A=3∶1)。減壓抽去過量的冰乙酸，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=4∶1，TLC檢測分管收集)純化，洗脫液作ESI-MS檢測，收集分子量為216的洗脫液，減壓蒸干得乳黃色粉末PPMP 3.09 g，收率 73.90%，純度 99.20%(HPLC)，m.p.112℃～114℃;UV-Vis(EtOH):λmax=248 nm;1H NMR δ:1.24(d，J=7.02 Hz，6H，CH3)，2.19(s，3H，5-CH3)，2.91(sept，J=7.02 Hz，1H，CHMe2)，3.45(s，2H，CH2)，7.25，7.40(AA'XX'，4H，ArH);13C NMR δ:16.95［CH(CH3)2］，23.90(5-CH3)，33.57(CH2)，42.93［CH(CH3)2］，119.09(N=C)，126.65，135.60(CH in Ar)，145.77，156.06(C in Ar)，170.37(C=O);ESI-MS m/z:217.4{［M+H］+};Anal.calcd for C13H16N2O:C 72.20，H 7.45，N 12.95;found C 72.27，H 7.39，N 12.93。

1.3 d5-PMP，DPP和PPMP與乳糖的衍生化性能測定

以乳糖(Lac)為研究對象，考察了d5-PMP，DPP和PPMP與Lac的反應(yīng)活性及產(chǎn)物L(fēng)ac-d5-PMP，Lac-DPP及Lac-PPMP的ESI-MS響應(yīng)情況［以β-環(huán)糊精(CD)為內(nèi)標(biāo)物］。

取100 mmol·L-1的 Lac 水溶液 10 μL，加入10 mmol·L-1的 CD水溶液100 μL制得溶液 A。溶液A用蒸餾水稀釋至1.0 mL用于ESI-MS檢測。

取溶液A 3份，分別加入50 mmol·L-1的d5-PMP，DPP及PPMP的甲醇溶液150 μL和氨水100 μL，渦旋混勻后，封蓋于70℃(浴溫)反應(yīng)30 min。氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)铀?.0 mL和二氯甲烷1.0 mL充分溶解、震蕩，于13 000 rpm·min-1離心3 min。棄去二氯甲烷相，同法再萃取兩次以除盡過量的衍生化試劑。水相稀釋10倍后，進(jìn)行ESIMS檢測［正離子模式;電噴霧電壓:4.80 kV;鞘氣(N2):30.00 arb;輔助氣(N2):7.00 arb;吹掃氣(N2):0 arb;離子傳輸毛細(xì)管溫度:375℃;管透鏡電壓:250 V;掃描范圍:中分子量端200～2000;流動(dòng)相:50%甲醇;流速:200 μL·min-1;2 μL定量環(huán)進(jìn)樣］。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

分析反應(yīng)機(jī)理可知，以肼類衍生物和β-酮酸酯為原料合成吡唑啉酮類化合物的反應(yīng)，是以生成腙為中間體的兩步反應(yīng)組成的，而酸可以催化肼與醛酮生成腙的反應(yīng)［12］。但采用強(qiáng)酸可能會(huì)使苯肼完全質(zhì)子化，失去親核性能，反應(yīng)活性降低。因此本研究加入AcOH作為催化劑提高反應(yīng)產(chǎn)率。此外，固相合成也是提高有機(jī)合成收率的一個(gè)途徑［10］。Mojtahedi等［3］研究表明，超聲波介導(dǎo)也可以提高苯肼或者肼類與β-酮酸酯合成吡唑啉酮類化合物產(chǎn)率。本文綜合文獻(xiàn)方法，探討了AcOH催化、超聲波作用以及溶劑對合成PMP收率的影響，結(jié)果見表1。由表1可見，有AcOH存在的反應(yīng)體系中PMP的收率是無AcOH時(shí)的2倍以上，說明AcOH對此反應(yīng)有明顯的催化作用。在AcOH催化下，無超聲介導(dǎo)的無溶劑反應(yīng)體系的收率(78.5%)比甲醇溶劑體系的收率(69.2%)高出9.3%，比AcOH催化、超聲介導(dǎo)的無溶劑體系的收率(74.3%)高出4.2%，說明無溶劑的固相合成對該反應(yīng)收率的提高很有效;另外由于該反應(yīng)生成PMP的同時(shí)釋放出乙醇和水，無溶劑體系有利于該反應(yīng)平衡正向進(jìn)行。在本實(shí)驗(yàn)中，超聲波的作用并沒有使收率在原有的基礎(chǔ)上提高，反而下降。這可能是因?yàn)槌暡ǖ目栈饔檬沟梅磻?yīng)體系溫度升高，導(dǎo)致副產(chǎn)物增多的緣故。本實(shí)驗(yàn)采用以AcOH催化的無溶劑室溫反應(yīng)合成工藝對1，3-取代的吡唑啉酮類試劑進(jìn)行合成。

表1 反應(yīng)條件對合成PMP收率的影響*Table 1 Effect of reaction conditions on synthesizing yield of PMP

2.2 d5-PMP，DPP和PPMP與Lac的衍生化性能

Lac-d5-PMP，Lac-DPP及 LAc-PPMP(于 70℃反應(yīng)40 min，其余條件同1.3)產(chǎn)物的 ESI-MS譜圖見圖1。

圖1 Lac-DPP，Lac-PPMP和Lac-d5-PMP的ESI-MS譜圖Figure 1 ESI-MS spectra of Lac-DPP，Lac-PPMP和Lac-d5-PMP

由圖1可見，在三個(gè)譜圖中均出現(xiàn)了包括CD，剩余 Lac以及 Lac與 DPP，PPMP和 d5-PMP的兩種標(biāo)記產(chǎn)物(單分子和雙分子標(biāo)記物)在內(nèi)的4種物質(zhì)的峰{［M+Na］+}。為了便于比較，根據(jù)Lac與CD分子離子峰的豐度比，初步判斷衍生試劑與Lac標(biāo)記的活性大小;根據(jù)Lac與衍生試劑的單分子標(biāo)記物和雙分子標(biāo)記物分子離子峰豐度比大小，判斷標(biāo)記衍生試劑的主要類型。由圖1中豐度比可見，Lac/CD分子離子峰豐度比的順序?yàn)?DPP＞PPMP＞d5-PMP(d0-PMP)，表明三種試劑與Lac的標(biāo)記反應(yīng)活性為d5-PMP(d0-PMP)＞PPMP＞DPP;DPP的反應(yīng)活性最差。豐度比 Lac-PPMP/Lac-2PPMP＞Lac-DPP/Lac-2DPP＞Lac-d5-PMP/Lac-2d5-PMP，說明 PPMP生成單分子標(biāo)記物的傾向最大，d5-PMP生成雙分子標(biāo)記物的傾向最大，而DPP由于受反應(yīng)活性和基團(tuán)空間位阻的影響，兩種標(biāo)記產(chǎn)物的豐度相當(dāng)。在對衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中也表明，無論如何改善反應(yīng)條件，均無法使DPP與Lac的標(biāo)記反應(yīng)完全、主產(chǎn)物唯一。而PPMP和d5-PMP均可以在其優(yōu)化的衍生條件下和Lac反應(yīng)完全，并能得到預(yù)期標(biāo)記的主產(chǎn)物。

1，3-取代的吡唑啉酮試劑與還原糖之間的反應(yīng)表現(xiàn)出的這種反應(yīng)活性和反應(yīng)產(chǎn)物上的差異，可從該類試劑和還原糖反應(yīng)的機(jī)理來分析(Scheme 2)。由于1，3-取代的吡唑啉酮試劑的4-C存在α-氫，在堿性環(huán)境下離去成為烯醇式負(fù)離子，和糖類物質(zhì)的還原端進(jìn)行醛酮之間的縮合反應(yīng)，在加熱條件下失水成為具有α，β-不飽和酮結(jié)構(gòu)的單分子標(biāo)記物。此單分子標(biāo)記物會(huì)繼續(xù)與另一分子吡唑啉酮試劑的烯醇式負(fù)離子進(jìn)行Michael 1，4加成反應(yīng)，從而也可能使糖類物質(zhì)標(biāo)記上雙分子吡唑啉酮試劑。

Scheme 2

顯然，加熱升溫有利于第一步醛酮之間縮合反應(yīng)的發(fā)生，生成吡唑啉酮試劑對糖類物質(zhì)的單分子標(biāo)記物。而隨后發(fā)生的第二步反應(yīng)為單分子標(biāo)記物與吡唑啉酮試劑之間的Michael加成反應(yīng)，是一個(gè)放熱可逆反應(yīng)［13］，低溫有利于該反應(yīng)正向進(jìn)行，生成吡唑啉酮試劑對糖類物質(zhì)的雙分子標(biāo)記物。因此，反應(yīng)溫度是影響PPMP衍生化糖類物質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的一個(gè)關(guān)鍵因素，優(yōu)化反應(yīng)溫度可以使反應(yīng)向主產(chǎn)物方向進(jìn)行。對于DPP與還原糖的反應(yīng)活性不如PPMP和PMP，并且產(chǎn)物不均一，可能是因?yàn)檫吝蜻h(huán)上3-R的空間位阻對該反應(yīng)的活性影響較大所致。

3 結(jié)論

在AcOH催化的無溶劑條件下，于室溫合成了d5-PMP，DPP和PPMP。該合成工藝操作簡單、收率較高，為解決市場上d5-PMP的短缺問題提供了技術(shù)參考。同時(shí)豐富了糖類物質(zhì)的衍生化和同位素標(biāo)記試劑的種類。

d5-PMP和PPMP與還原糖的反應(yīng)活性較高，衍生物分別以雙分子標(biāo)記物和單分子標(biāo)記物為主;優(yōu)化衍生條件可用于糖類物質(zhì)分析。DPP的反應(yīng)活性最低，不適用于糖類物質(zhì)的定量衍生。

［1］ Jung J C，Watkins E B，Avery M A.Synthesis of 3-substituted and 3，4-disubstituted pyrazolin-5-ones［J］.Tetrahedron，2002，58(18):3639-3646.

［2］ 趙劍鋒，徐利敏，雷玉平，等.1-苯基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮衍生物的合成［J］.化學(xué)與生物工程，2007，24(7):30-31.

［3］ Mojtahedi M M，Javadpour M，Abaee M S.Convenient ultrasound mediated synthesis of substituted pyrazolones under solvent-free conditions［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2008，15(5):828-832.

［4］ Honda S，Akao E，Okuda M，et al.High-performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly ultraviolet-absorbing and electrochemically sensitive 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives［J］.Anal Biochem，1989，180(2):351-357.

［5］ Honda S，Suzuki S，Taga A.Analysis of carbohydrates as 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives by capillary/microchip electrophoresis and capillary electrochromatography［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2003，30(6):1689-1714.

［6］ 王樹清，高崇.1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的合成工藝研究［J］.染料與染色，2004，41(2):114-115.

［7］ Tietze L F，Steinmetz A.A general and expedient method for the solid-phase synthesis of structurally diverse 1-phenyl-pyrazolone derivatives［J］.Synlett，1996，(7):667-668.

［8］ Kuo S C，Huang L J，Nakamura N.Studies on heterocyclic compounds，6，synthesis and analgesic and antiinflammatory activities of 3，4-dimethylpyrano-［2，3-c］pyrazol-6-one derivatives［J］.J Med Chem，1984，27(4):539-544.

［9］ Tietze L F，Evers H，Hippe T，et al.Solid-phase synthesis of substituted pyrazolones from polymer-bound βketo esters［J］.Eur J Org Chem，2001，(9):1631-1634.

［10］ Mojtahedi M M，Jalali M R，Bolourtchian M.Facile synthesis of pyrano［2，3-c］pyrazol-6-one derivatives under microwave irradiation in solvent-free conditions［J］.Synth Commun，2006，36(1):51-57.

［11］ 沈磊，楊文革，胡永紅，等.鄰氰基苯肼的合成研究［J］.廣東化工，2009，36(10):46-47.

［12］ 胡洪文.有機(jī)化學(xué)上冊(第二版)［M］.北京:高等教育出版社，1990.

［13］ 邢其毅，裴偉偉，徐瑞秋，等.基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)(第三版)上冊［M］.北京:高等教育出版社，2005.