楊家齊，張延英，朱建坤，吳建軍，舒 暢

（1.大唐八0三發(fā)電廠衛(wèi)生院，甘肅 蘭州 732800；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

貞芪酪蛋白復(fù)合肽是根據(jù)“扶正培本、扶正祛邪”的祖國醫(yī)學(xué)理論，以黃芪、女貞子及酪蛋白復(fù)合肽等組方經(jīng)特定制劑工藝研制而成。該方劑符合中醫(yī)組方原則，是針對惡性腫瘤的發(fā)病機制而研制的。酪蛋白復(fù)合多肽在保健品、醫(yī)藥等多領(lǐng)域起著特殊的作用。近年來，肽在人體中的作用已引起科學(xué)界的高度重視，大量研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)攝入后，并不能完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式被吸收；其藥物血清可抑制人肝癌細胞的增殖，顯著降低細胞核質(zhì)比，抑制細胞分泌AFP，降低細胞γ-GT活性，升高ALP活性，并有顯著抑制人肝癌細胞端粒酶活性的作用[1]，其含藥血清對人肺腺癌細胞A549有一定抑制作用[2]。本文通過體外抑制Hela細胞，探討貞芪酪蛋白肽含藥血清抗腫瘤功能及作用機理。

1 材料

1.1 動物

SD雄性大鼠30只，體重200～300g，SPF級，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK（甘）2011-0001，制備藥物血清用；制備藥物血清的動物實驗在甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級動物實驗室進行，動物實驗設(shè)施使用證編號：SYXK（甘）2011-0001。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%新生牛血清和青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HeLa細胞株。待單層細胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度用于后續(xù)實驗。

1.3 藥物與試劑

貞芪酪蛋白復(fù)合肽（LACP）由黃芪、女貞子和酪蛋白復(fù)合肽組成。中藥購自蘭州市黃河藥材公司，酪蛋白復(fù)合肽由蘭州同健生物公司提供。注射用環(huán)磷酰胺（國藥準字H32020857），由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、MTT購自蘭州生升醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司。

1.4 儀器設(shè)備

全自動酶標儀，美國伯樂公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)，型號ZX-71-22PH/FL；CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO公司生產(chǎn)，型號MCO-15AC；生物安全柜，香港HFsafe公司生產(chǎn)，型號760S。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物血清的制備

參照文獻方法[3]。取30只大鼠分為空白血清組（靜脈點滴蒸餾水）、陽性藥環(huán)磷酰胺組（200mg/kg）、LACP含藥血清組（1.0g/mL·200g-1）。陽性藥組環(huán)磷酰胺灌胃，每次給藥200mg/mL·kg-1），LACP 提取液灌胃，每次給藥 1.0g/mL·200g-1），兩次/天；對照組給同體積蒸餾水，每組10只，連續(xù)3天，第4天一次給予全日劑量1h后，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下從大鼠股靜脈采血，靜置3～4h，于4℃，3000r/min離心20min，分離血清。將同一組大鼠的血清混勻，56℃滅活30min，4℃保存?zhèn)溆?。用不含血清?640溶液稀釋成40%、20%，分別過濾，于-20℃保存。

2.2 含藥血清對Hela細胞的抑制作用[4]

采用MTT法。取對數(shù)生長期的Hela細胞，4×103/mL接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入含藥血清，每孔200μL，含藥血清終末濃度為20%、10%。用同濃度空白血清作對照，繼續(xù)培養(yǎng)至48h，然后分別加入MTT溶液（5mg/mL，生理鹽水配制）。繼續(xù)培養(yǎng)4h，于3×103r/min離心10min，棄上清液，加入DMSO 200μL，輕振10min后用酶標儀測A550。做組間t檢驗，并計算抑制率。全自動酶標儀測定各孔A值，按如下公式計算抑制率，抑制率=（對照組A均值-實驗組A均值/對照組A均值）×100%。

2.3 統(tǒng)計方法

2.4 結(jié)果

LACP灌胃給藥后，分離的小鼠血清對Hela細胞有抑制作用。LACP 20%、10%含藥血清組與空白血清組比較，均具有極顯著性差異（P＜0.01），與環(huán)磷酰胺組血清比較，也具有極顯著性差異（P＜0.01），說明LACP含藥血清在體外具有一定的抗Hela細胞增殖的作用（見表1）。

表1 LACP大鼠含藥血清對Hela細胞的影響（n=10）

3 討論

腫瘤的發(fā)生是多種基因的異常表達導(dǎo)致細胞凋亡的結(jié)果，因此，有效控制腫瘤細胞的異常凋亡是治療腫瘤的有效途徑；利用體外實驗進行藥物篩選具有簡便、經(jīng)濟、可行等優(yōu)點，因而被普遍采用；隨著分子腫瘤學(xué)研究的不斷深入，含藥血清的體外抗腫瘤實驗已成為抗腫瘤藥物篩選過程中必不可少的一部分[5]。近年來，從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中發(fā)掘新的抗癌藥物用于腫瘤治療已成為趨勢，中藥的抗癌效應(yīng)正受到越來越多的關(guān)注。惡性腫瘤屬于中醫(yī)學(xué)，積聚、噎嗝、虛勞、乳巖等范疇，其病機主要是瘀血內(nèi)停、痰濕停聚、氣血陰陽虧虛，治則主要為活血化瘀、燥濕化痰、清熱解毒、扶正固本、以毒攻毒等。中藥是我國治療腫瘤的傳統(tǒng)方法，中藥治療疾病的主要方法是復(fù)方，因中藥復(fù)方是一個有機整體，可互增療效，以最大限度地治療疾病。

實驗結(jié)果表明：LACP含藥血清對Hela細胞有一定抑制作用，初步顯示的劑量反應(yīng)關(guān)系進一步證明其具有抗Hela腫瘤細胞作用，其中，20%含藥血清對Hela細胞抑制率為53.09%，10%含藥血清的抑制率為35.60%，顯示出良好的體外抑癌效果，與環(huán)磷酰胺組血清比較，也具有極顯著性差異。黃芪、女貞子作為一種傳統(tǒng)中藥，傳統(tǒng)上就用于腫瘤的輔助治療，通過我們的研究，也有可能用于宮頸癌的化療，但其抗腫瘤的確切機制及臨床應(yīng)用劑量和療效等還需做深入研究。

[1]張延英，朱建坤，吳建軍，等.貞芪酪蛋白肽藥物血清誘導(dǎo)Bel-7402細胞分化的體外實驗研究 [J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14（9）：47-50.

[2]張延英，吳建軍，王鵬善，等.貞芪酪蛋白肽復(fù)合物血清對人肺腺癌A549細胞分化抑制作用及相關(guān)機制研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（4）：114-117.

[3]劉平，周建鋒，胡義揚，等.益氣養(yǎng)陰誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細胞分化作用與意義[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6（8）：29-33.

[4]孟李，王寧生.含藥血清的制備方法研究[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（5）：290.

[5]Lampertico P，Malter JS，Gerber MA.Development and application of an in vitro model for screening anti－h(huán)epatitis B virus therapeutics[J].Hepatology，1991，13（3）：422－426.