江雪豐 周希瑗

多貝斯干預(yù)前后TSP-1在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)

江雪豐 周希瑗

目的 檢測(cè)TSP-1在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)并探討其作用。方法 采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型, 成模后隨機(jī)分成兩組,糖尿病組和多貝斯組,其中, 多貝斯治療組在出現(xiàn)糖尿病表現(xiàn)后按100 mg/kg/d, 糖尿病組和正常對(duì)照組只在同期灌胃等量生理鹽水。注射后1、3個(gè)月采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)視網(wǎng)膜中TSP-1陽性反應(yīng)及其分布。結(jié)果 各組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)陽性著色的積分光密度值均較正常組降低(P＜0.05)。結(jié)論 TSP-1蛋白質(zhì)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)明顯降低并與病程有關(guān), 提示TSP-1表達(dá)不足可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的原因之一。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；免疫組織化學(xué)；血小板反應(yīng)蛋白-1, 多貝斯

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥, 是不可逆性失明的重要原因［1］,其發(fā)病機(jī)理比較復(fù)雜, 受多種血管刺激因子和抑制因子調(diào)控。血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-l, TSP-1)已被公認(rèn)為一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制因子。作者通過研究TSP-1蛋白在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá), 探討其可能在DR中意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立 實(shí)驗(yàn)用封閉群雄性Wistar大鼠60只, 體質(zhì)量180~280 g, 標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng), 不限飲食。實(shí)驗(yàn)前禁食12h, 自由飲水。將鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ;Sigma公司)按65 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射, 注射后24~48h檢測(cè)血糖濃度達(dá)16.65 mmol/L, 尿糖達(dá)+++-~++++為模型建立成功。成模后隨機(jī)分為糖尿病組(10只x 2)、多貝斯治療組(10只x 2), 另取20只正常大鼠作為正常對(duì)照組。多貝斯治療組在出現(xiàn)糖尿病表現(xiàn)后按100 mg(kg·d)灌胃, 糖尿病組和正常對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。

1.2 眼球標(biāo)本的取材和制片 分別于1月、3月將各組大鼠以體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔麻醉。摘除眼球, 固定,沖洗、脫水、透明, 浸蠟, 包埋, 備用。連續(xù)6μm切片用于免疫組化。

1.3 各組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)SP法, 主要操作步驟為：切片脫蠟、水化； 3%H2O2滅內(nèi)源性過氧化物酶活性；微波修復(fù)抗原, 封閉非特異性抗原；滴加TSP-1一抗(稀釋度為1：100), 4℃過夜； 滴加生物素化二抗及辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液, DAB顯色, 蘇木精復(fù)染,常規(guī)梯度乙醇脫水, 透明, 膠封、鏡檢。

1.4 圖像采集分析 采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)測(cè)定視網(wǎng)膜TSP-1的積分光密度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析, 以(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組TSP-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

光鏡觀察1個(gè)月時(shí), 正常對(duì)照組中TSP-1蛋白質(zhì)的陽性反應(yīng)表達(dá)分布于視網(wǎng)膜的內(nèi)界膜、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層, 呈深棕黃色；TSP-1蛋白質(zhì)在糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)空間范圍同正常組,呈棕黃色, 與正常組比較明顯下降, 內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層降低尤為明顯,P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 多貝斯干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)也降低, 基本同糖尿病組；3個(gè)月時(shí), 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低, 尤其在內(nèi)叢狀層、外叢狀層呈極微弱的陽性表達(dá), 而多貝斯干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)呈中等程度, 陽性反應(yīng)程度及表達(dá)區(qū)域較同時(shí)期糖尿病組顯著增加(見表1)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中TSP-1平均積分光密度值的圖像分析結(jié)果s)

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜中TSP-1平均積分光密度值的圖像分析結(jié)果s)

注：a表 示和糖尿病組比較P＜0.05

組別1個(gè)月3個(gè)月正常對(duì)照組26.34±3.40a25.91±3.31a糖尿病組21.5±3.0215.93±2.41多貝斯組22.43±3.5923.23±3.16*

3 討論

DR是糖尿病微血管并發(fā)癥之一, 基本病理過程表現(xiàn)為微循環(huán)障礙, 主要病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜血管滲透性增加, 新生血管形成, 最終導(dǎo)致視功能不可逆性損害［2］。TSP-l已被公認(rèn)為一種有效的內(nèi)源性血管生成抑制因子, 在體外可直接抑制兔黃體、牛腎上腺皮質(zhì)、肺動(dòng)脈以及人臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞增殖, 這種抑制作用可被抗TSP-1的單克隆抗體所中和［3-5］。有研究表明, 在氧誘導(dǎo)的缺血性視網(wǎng)膜病變過程中TSP-1的表達(dá)增加可使視網(wǎng)膜前新生血管減弱［3］。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)TSP-1在視網(wǎng)膜周細(xì)胞的增殖擴(kuò)散和遷移中起了重要作用并影響視網(wǎng)膜血管的發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡［6］。TSP-1的抗血管新生作用受到眾多學(xué)者關(guān)注。

本試驗(yàn)表明, TSP-1免疫陽性反應(yīng)在正常大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)較強(qiáng), 主要表達(dá)于內(nèi)界膜、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層 。而在 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中, TSP-1蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)比正常大大減弱, 并隨病程的延長有逐漸減少的趨勢(shì), 表達(dá)的空間范圍亦有所縮小, 藥物組中TSP-1的表達(dá)升高?？紤]多貝斯是臨床療效確切的DR微血管保護(hù)劑, 可有效改善視網(wǎng)膜微循環(huán), 促進(jìn)DR病情的穩(wěn)定或改善。上述免疫組化結(jié)果表明TSP-1在眼部血管自身穩(wěn)定中起一定的重要作用以及它的降低與早期糖尿病相關(guān)的血管異常有關(guān),其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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330009 江西省南昌市第三醫(yī)院眼科(江雪豐)； 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科(周希瑗)

江雪豐 Email：jxfeng2005@126.com