紀(jì)鳳卿 藤 菁 賴 力 韓麗麗 沈曉麗▲

1.福建省廈門市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建廈門 351009；2.福建省立醫(yī)院司法鑒定所，福建福州 351004

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）又稱微衛(wèi)星DNA（micro satellite DNA），是一種廣泛存在于人類基因組中可遺傳、不穩(wěn)定、且具高度多態(tài)性的DNA序列[1]。目前人類基因組內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了七千個以上的STR位點(diǎn)，平均每15kb就存在一個STR基因座。由于STR核心單位重復(fù)數(shù)目的變化，構(gòu)成了STR基因座的遺傳多態(tài)性。STR基因座因其分布廣泛、信息量大，基因片段短、擴(kuò)增效率高、易于檢測，判型準(zhǔn)確，且具有高度多態(tài)性并遵循孟德爾共顯性遺傳等諸多優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于遺傳連鎖分析、腫瘤等疾病相關(guān)基因的定位、器官移植、人類遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定及個體識別、身源認(rèn)定等研究領(lǐng)域。由于STR 的基因頻率和基因型的分布在不同地區(qū)之間存在差異，法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值及特點(diǎn)都有所不同，因此，各實(shí)驗(yàn)室利用STR 遺傳標(biāo)記開展群體遺傳學(xué)研究及法醫(yī)鑒定工作[2]，國內(nèi)外許多DNA 實(shí)驗(yàn)室致力于DNA 檢測基因座的群體遺傳學(xué)研究[3-6]，以尋找到適合于不同民族、不同群體個人識別和親權(quán)鑒定的基因座。本研究對350例福建福州地區(qū)漢族無關(guān)個體的15個STR基因座遺傳多態(tài)性進(jìn)行調(diào)查，并對其應(yīng)用進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 樣本

取來自福建省立醫(yī)院司法鑒定所2012年3月～2013年1月的日常檢案，總共350例無關(guān)個體，均來自福州五區(qū)八縣地區(qū)漢族人群。

1.2 DNA提取

采用chelex-100快速提取法從血樣中提取DNA，經(jīng)DNA濃度測定符合標(biāo)準(zhǔn)后-20℃保存。

1.3 試劑

AmpFlmSTR IdentifilerTM 試劑盒（ABI，美國）。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)在Eppendorf Master Gradient型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1.5 毛細(xì)管電泳

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)550及去離子甲酰胺（HIDI）混勻，95℃變性 3min，立即冷卻到 4℃，在Applied Biosystems 3130遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.6 熒光檢測分型

用基因掃描軟件（Date collection）檢測擴(kuò)增片段的熒光標(biāo)記，以LIZ-550等為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)擴(kuò)增的STR片段大小確定STR基因座，以等位基因梯階（Ladder）為標(biāo)準(zhǔn)，用基因分型軟件（Genemapper ID v3.1）確定15個常染色體STR基因座的等位基因型。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

運(yùn)用PowerMarker V3. 1軟件及Modified-powerstate 軟件記錄無關(guān)個體的基因型，對15個STR 基因座進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，計算各STR 基因座等位基因數(shù)目及基因型數(shù)目、等位基因頻率、雜合度觀察值Ho、個人識別DP、非父排除概率 PE、多態(tài)信息含量PIC 以及該15個基因座的累計個人識別率TDP、累計非父排除概率 CPE。

2 結(jié)果

350份福州地區(qū)漢族無關(guān)個體15個STR基因座的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），具體見表1。350例福州地區(qū)漢族無關(guān)個體發(fā)現(xiàn)的稀有等位基因情況見表2。檢測的15個STR遺傳標(biāo)記均具有高度多態(tài)性，除基因座TPOX外，其他基因座雜合度均超過0.60， 匹配概率 0.032～0.225，個體識別力 0.775～0.968， 多態(tài)性信息含量0.55～0.86，非父排除率0.285～0.761，具體見表3。

表1 福州地區(qū)漢族群體15個STR基因座等位基因頻率

表2 福州地區(qū)漢族群體15個STR基因座的各項(xiàng)法醫(yī)遺傳學(xué)參數(shù)

表3 福州地區(qū)350個無關(guān)個體發(fā)現(xiàn)的稀有等位基因情況

3 討論

3.1 應(yīng)用STR 基因座作為親子鑒定的優(yōu)點(diǎn)

STR 基因座在人類基因組中分布廣泛，基因片段長度差異較小，容易擴(kuò)增，各基因座的擴(kuò)增條件相似，沒有優(yōu)先擴(kuò)增的問題，適用復(fù)合擴(kuò)增，簡化程序，分型規(guī)范，自動化程度高，效率高[7]。本研究對15個STR基因座進(jìn)行基因分型，其重復(fù)單位在3～5bp，因此分型結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性好，符合理想STR基因座的條件。

3.2 IdentifilerTM體系15個STR基因座在福州漢族人群中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評估

這15個STR基因座在福州地區(qū)漢族人群中基因頻率分布均勻，表現(xiàn)出高度多態(tài)性，分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。Gin等[8]認(rèn)為DP≥0.9，H≥0.7的基因座具有高鑒別力。按此標(biāo)準(zhǔn)，本研究選擇的10個基因座 D8S1179、D13S317、D19S433、D18S51、D21S11、D16S539、vWA、D5S818、D2S1338、FGA屬于高鑒定力、高雜合度的基因座。這15個STR基因座具有較高法醫(yī)學(xué)個人識別和親子鑒定運(yùn)用價值。通常情況下檢測這些試劑盒的STR 基因座已能夠基本滿足法醫(yī)物證中個體識別和三聯(lián)體親子鑒定的檢測要求。但是在一些二聯(lián)體和出現(xiàn)了突變可能的三聯(lián)體案件中，需要增加檢測更多的STR 基因座。有關(guān)方面的研究進(jìn)展還待于學(xué)者們進(jìn)一步的探索。一方面STR 基因座具有高度多態(tài)性， 另一方面，STR 的突變率也很高[9-10]。故2010年由司法部制訂出臺的親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范中對常染色體STR基因座的選擇有明確的要求[11]：（1）經(jīng)過群體遺傳學(xué)調(diào)查，多態(tài)性高，非父排除率在0.7以上。（2）經(jīng)過500次以上減數(shù)分裂的家系調(diào)查，基因座的突變率在0.002以下。按此標(biāo)準(zhǔn)，IdentifilerTM體系15個STR基因座在福州漢族人群中的非父排除率只有D18S51、FGA兩個基因座滿足0.7以上，其余13個基因座并沒達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)。同類的現(xiàn)象在本地區(qū)曾健等[12]學(xué)者的研究中也見報道。本研究認(rèn)為可能是IdentifilerTM體系的15個STR基因座主要是針對歐美群體而設(shè)計的，并非完全符合福州地區(qū)人群個體識別和體親子鑒定的檢測要求。為此學(xué)者必須進(jìn)一步尋求更符合該地區(qū)鑒定要求的新的STR基因座。

3.3 福州漢族人群中所發(fā)現(xiàn)罕見等位基因的應(yīng)用價值

當(dāng)大量群體進(jìn)行STR分型時，往往會發(fā)現(xiàn)一些新的等位基因。由于這些等位基因在等位基因階梯中沒有對應(yīng)大小的片段，通常需要自己去定義，在實(shí)踐中稱這些等位基因[13]為“off-ladder（OL）”等位基因，即罕見等位基因。本研究所發(fā)現(xiàn)稀有等位基因均在美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所（NIST）STRBase網(wǎng)站上公布的各種常用STR基因座的“offladder ”等位基因范圍內(nèi)。其類型有兩種[14]：一是超出該基因座ladder范圍的罕見等位基因（第一類型）；二是出現(xiàn)在兩個等位基因之間的罕見等位基因（第二類型）。國內(nèi)學(xué)者徐志成等[15]用IdentifilerTM系統(tǒng)對罕見等位基因及其頻率的研究提出，IdentifilerTM檢測系統(tǒng)中，ladder主要以歐美等西方人群遺傳背景為基礎(chǔ)制備，而 STR基因座的核心序列，在不同種族的人群中分布差異較大，因此該體系并不完全適用于中國人群的基因檢測。這些罕見等位基因的出現(xiàn)，給檢測結(jié)果判讀帶來一定的困難。而本研究也認(rèn)為罕見等位基因的存在及其確定，有助于提高各STR基因座的個體識別能力、非父排除率等。同時也提示各試劑生產(chǎn)公司應(yīng)制備更加完善的、 適合中國人群的 ladder以分析這些數(shù)據(jù)。尤其在試劑國產(chǎn)化的過程中更加要注重這方面數(shù)據(jù)的收集，并將這些數(shù)據(jù)放在ladder中，使DNA個體識別和親權(quán)鑒定的試劑更加符合中國人群。當(dāng)然，若要發(fā)現(xiàn)更多稀有等位基因，無疑需要進(jìn)一步擴(kuò)大群體數(shù)量。

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