張梅虹 章學(xué)英 杜鵑

（復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院兒科，上海 201508）

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）是一種增殖性視網(wǎng)膜病變，是兒童致盲的主要眼病之一。目前研究［1］認(rèn)為，ROP是由于早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜發(fā)育不全及病理性新生血管形成所致。血管新生是血管生成刺激因素和血管生成抑制因素相互作用的結(jié)果。色素上皮衍生因子（pigment epi－thelium derived factor，PEDF）是目前已知的天然存在于眼內(nèi)的最強(qiáng)新生血管抑制因子，它能拮抗多種促血管生長(zhǎng)因子，有效抑制視網(wǎng)膜新生血管的生長(zhǎng)，而不干擾視網(wǎng)膜血管的正常發(fā)育［2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察高氧誘導(dǎo)的ROP小鼠模型視網(wǎng)膜PEDF的表達(dá)及血清PEDF水平的變化，探討PEDF在ROP小鼠模型不同階段中的作用，為臨床研究ROP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇7日齡健康C57BL／6J新生小鼠112只，雌雄不拘，新生小鼠未斷奶，與哺乳母鼠一同飼養(yǎng)，平均每窩6只。C57BL／6J新生小鼠為清潔級(jí)動(dòng)物，由上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。將新生小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組（n＝56）與對(duì)照組（n＝56）。模型組新生小鼠于生后第7天與哺乳母鼠一起置于密閉氧箱內(nèi)飼養(yǎng)，氧箱一端為進(jìn)氣孔，接入濕化的氧氣和氮?dú)獾幕旌蠚怏w，氧氣流量3～4 L／min，氮?dú)饬髁?.5～1 L／min；另一端為出氣孔，氧箱頂端有測(cè)氧孔，連接氧氣分析儀（美國(guó)Ceramatec公司生產(chǎn)，型號(hào)：OM－25AE），每天監(jiān)測(cè)氧濃度5次，使氧箱內(nèi)氧濃度維持在（75±2）%，控制室溫在（23±2）℃，日光照明。每2 d打開(kāi)氧箱更換母鼠、墊料，添加飼料和水。在高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d，于生后第12天返回到空氣環(huán)境中與母鼠共同飼養(yǎng)。對(duì)照組新生小鼠和哺乳母鼠一起在（23±2）℃環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 視網(wǎng)膜鋪片的制作（ADP酶組織化學(xué)法） 2組分別取生后第12、14、17天新生小鼠各3只（6只眼），腹腔內(nèi)注射氯胺酮40～50 mg／kg麻醉，4%多聚甲醛溶液左心室灌注后，立即摘取眼球并將其固定于4%多聚甲醛溶液中，4℃過(guò)夜。解剖顯微鏡下沿角膜緣后約1 mm處環(huán)行剪開(kāi)，去除角膜、晶狀體、玻璃體、鞏膜、脈絡(luò)膜，以視乳頭為中心作4～5個(gè)放射狀切口；用0.05 mol／L的Tris－馬來(lái)酸緩沖液（pH7.2）漂洗；37℃反應(yīng)液中孵育15 min［反應(yīng)液：濃度0.2 mol／L的Tris－馬來(lái)酸緩沖液（pH7.2）中加入3 mmol／L硝酸鉛、6 mmol／L氯化鎂、1 mg／mL ADP，ADP由美國(guó)Sigma公司提供］；漂洗后用10%硫化銨顯色，甘油明膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管發(fā)育及增生的情況。

1.3 視網(wǎng)膜冷凍切片的制作 2組分別取生后第12、17、22天新生小鼠各5只（10只眼），氯胺酮麻醉，4%多聚甲醛灌注后摘取眼球，剪去角膜和前房，除去玻璃體，將剩下的眼球壁標(biāo)本放入4%多聚甲醛中固定1 h；用0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗標(biāo)本后置于30%蔗糖中，4℃過(guò)夜。吸去標(biāo)本上液體，浸入OCT液中，在－20℃冷凍切片機(jī)上，做與視神經(jīng)矢狀軸平行的厚6μm的連續(xù)切片，選取切片時(shí)避開(kāi)視乳頭周?chē)?/p>

1.4 視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù) 2組分別取生后第12、17、22天新生小鼠各5只（10只眼），每只眼球每間隔30μm（5張）取1張切片，共取10張切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)每張切片上突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜并與內(nèi)界膜有緊密聯(lián)系的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核的數(shù)目，計(jì)算平均每只眼球每張切片的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目。

1.5 免疫組化法檢測(cè)視網(wǎng)膜PEDF的表達(dá) 2組分別取生后第12、17、22天新生小鼠各5只（10只眼），每只眼球每間隔30μm（5張）取1張切片，共取10張切片，按試劑盒要求進(jìn)行免疫組化操作。一抗：兔抗小鼠PEDF多克隆抗體，1∶100稀釋?zhuān)擅绹?guó)ADL公司提供；二抗（即用型）：二步法羊抗兔IgG［辣根過(guò)氧化物酶（HRP）］，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。以切片中見(jiàn)棕黃色顆粒（DBA染色）為陽(yáng)性。PEDF表達(dá)強(qiáng)度判斷：以細(xì)胞漿著棕褐黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，在高倍顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡視野的細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均每只眼球每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.6 血清PEDF檢測(cè) 2組分別取生后第7、12、17、22天新生小鼠各8只，用摘除眼球法采血（0.3～0.5）mL，靜置30 min，3000 r／min離心10 min，分離血清，－20℃保存。血清PEDF采用雙抗體夾心 ABC－酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)。操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。試劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供（一抗由美國(guó)ADL公司生產(chǎn)）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用STATA7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間結(jié)果的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間結(jié)果的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)學(xué)及定量觀察

2.1.1 視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)學(xué)觀察 與對(duì)照組比較，模型組小鼠在生后第12天（出氧箱當(dāng)天），視網(wǎng)膜血管管徑變細(xì)、分支減少、走行僵直，中央部視網(wǎng)膜可見(jiàn)大片無(wú)灌注區(qū)，周邊部視網(wǎng)膜仍可見(jiàn)部分小血管結(jié)構(gòu)；在生后第14天（出氧箱后2 d），視網(wǎng)膜血管明顯擴(kuò)張、迂曲，在視網(wǎng)膜灌注區(qū)和無(wú)灌注區(qū)交界的視網(wǎng)膜中周部開(kāi)始出現(xiàn)少量新生血管；在生后第17天（出氧箱后5 d）視網(wǎng)膜血管更加擴(kuò)張、迂曲，大量的新生血管形成，血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)及分布極其紊亂，可見(jiàn)新生血管叢、微血管瘤及滲出。見(jiàn)圖1。

2.1.2 視網(wǎng)膜新生血管的定量觀察 對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜未見(jiàn)或極少見(jiàn)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核。模型組小鼠在生后第17天和第22天時(shí)可見(jiàn)較多突破內(nèi)界膜長(zhǎng)入玻璃體的血管內(nèi)皮細(xì)胞核，單獨(dú)或成簇出現(xiàn)，與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)以及同組第12天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01和0.05）。見(jiàn)表1、圖2。

圖1 新生小鼠視網(wǎng)膜血管鋪片（A：×40，B：×400，ADP酶組織化學(xué)染色）

表1 新生小鼠視網(wǎng)膜不同時(shí)點(diǎn)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)（）

表1 新生小鼠視網(wǎng)膜不同時(shí)點(diǎn)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)（）

注：與同組生后第12天比較，＊P＜0.05

組別 n 眼 生后第12天 生后第17天 生后第22天 F值 P值模型組 5 10 0.7±1.1 69.4±9.3＊ 76.0±8.4＊ 332.86 0.000對(duì)照組 5 10 0.9±1.0 1.5±1.2 1.3±1.1 0.34 0.713 t值 －0.39 24.26 27.58 P值 0.705 0.000 0.000

圖2 模型組新生小鼠生后第17天視網(wǎng)膜組織切片（×400，HE染色）

2.2 不同時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜PEDF的表達(dá) 新生小鼠PEDF蛋白陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物呈棕黃色。見(jiàn)圖3。對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜PEDF蛋白在生后第12天時(shí)開(kāi)始略有表達(dá)，第17天時(shí)視網(wǎng)膜各層均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，第22天時(shí)維持高表達(dá)，第17天和第22天時(shí)均高于第12天時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組生后第12天時(shí)PEDF陽(yáng)性細(xì)胞百分率顯著高于對(duì)照組，第17天時(shí)則顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

圖3 模型組新生小鼠生后第12天視網(wǎng)膜PEDF的表達(dá)（×100，DBA染色）

2.3 血清PEDF水平的變化 對(duì)照組小鼠血清PEDF水平隨日齡的增大而呈波動(dòng)性變化：生后第7天和第12天時(shí)PEDF水平較低，第17天時(shí)增高（P＜0.05），第22天時(shí)又降至較低水平。模型組小鼠血清PEDF水平較低，生后第17天低于對(duì)照組（P＜0.05），生后第22天顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表2 2組新生小鼠不同時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜PEDF蛋白的表達(dá)（，%）

表2 2組新生小鼠不同時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜PEDF蛋白的表達(dá)（，%）

注：與同組生后第17天比較，＊P＜0.05；與同組生后第12天比較，△P＜0.05

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表3 不同時(shí)間點(diǎn)血清PEDF水平（，ng／L）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)血清PEDF水平（，ng／L）

注：與同組生后第17天比較，＊P＜0.05

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3 討 論

C57BL／6J小鼠視網(wǎng)膜血管在生后第7天開(kāi)始發(fā)育，此時(shí)視網(wǎng)膜血管發(fā)育最接近人類(lèi)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜血管的特點(diǎn)；而小鼠視網(wǎng)膜血管至第21天發(fā)育成熟時(shí)，則相當(dāng)于人類(lèi)胎兒孕4～5個(gè)月時(shí)的表現(xiàn)，因此本研究利用高氧后的相對(duì)低氧條件制作小鼠ROP模型。本研究應(yīng)用ADP酶法制作的視網(wǎng)膜鋪片，可清晰顯示視網(wǎng)膜淺層、深層及新生血管的分布和形態(tài)。在高氧環(huán)境中，模型組小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育停止；相對(duì)低氧后，中央部視網(wǎng)膜出現(xiàn)大片無(wú)灌注區(qū)，中周部的灌注區(qū)與無(wú)灌注區(qū)交界處有新生血管形成，生后第17天時(shí)達(dá)到高峰。通過(guò)對(duì)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)，可對(duì)視網(wǎng)膜新生血管進(jìn)行定量觀察，模型組小鼠生后第17天和第22天時(shí)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)顯著多于對(duì)照組。模型組眼部血管改變與ROP的視網(wǎng)膜病變相似，ROP動(dòng)物模型建立成功。

PEDF是一種多功能的糖蛋白，在人體和人眼組織中廣泛分布，其具有多種生物學(xué)活性，是天然存在于眼內(nèi)的血管生長(zhǎng)抑制劑，可抑制包括血管內(nèi)皮生 長(zhǎng) 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）在內(nèi)的多種血管生成誘導(dǎo)物的活性。本研究中，模型組小鼠在生后第12天時(shí)，視網(wǎng)膜PEDF蛋白過(guò)度表達(dá)，在一定程度上抑制了小鼠視網(wǎng)膜血管的正常發(fā)育，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織缺血缺氧；在生后第17天、第22天時(shí)，模型組小鼠視網(wǎng)膜PEDF蛋白表達(dá)顯著降低，而此期視網(wǎng)膜血管的增生也處于活躍期，其原因可能有兩方面：一方面當(dāng)PEDF蛋白表達(dá)減少時(shí)，其對(duì)視網(wǎng)膜血管增生的抑制作用大大減弱，另一方面由于視網(wǎng)膜組織缺血缺氧可誘導(dǎo)VEGF的過(guò)度表達(dá)，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜血管的增生，導(dǎo)致 ROP的發(fā)生［4］。

本研究還顯示，ROP模型組小鼠血清PEDF水平的變化趨勢(shì)與對(duì)照組相似，但整體水平較低，于生后第17天、第22天時(shí)ROP模型組小鼠血清PEDF水平低于對(duì)照組，而此期ROP模型組小鼠視網(wǎng)膜新生血管數(shù)也增多，提示血清PEDF水平的下降與視網(wǎng)膜新生血管的形成具有一定的相關(guān)性。但是，從本研究結(jié)果來(lái)看，模型組小鼠視網(wǎng)膜新生血管第17天時(shí)較第12天時(shí)增多，而ROP組血清PEDF水平生后第22天時(shí)才較第12天時(shí)降低，提示血清PEDF的降低在時(shí)相上滯后于視網(wǎng)膜血管的增生，因此對(duì)可能發(fā)生ROP的高危兒動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清PEDF水平并不能更早地預(yù)測(cè)ROP的發(fā)生。

本研究已證實(shí)PEDF在ROP的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但是如何早期發(fā)現(xiàn)和早期干預(yù)PEDF的異常表達(dá)從而預(yù)防ROP的發(fā)生還需要更深入的研究。

［1］ Smith LE.IGF－1 and retinopathy of prematurity in the preterm infant［J］.Biol Neonate，2005，88（3）：237－244.

［2］ 孔怡淳，韓梅，趙堪興.高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變模型中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和色素上皮衍生因子的表達(dá)及意義［J］.中華眼科雜志，2008，44（8）：734－740.

［3］ Matsuoka M，Ogata N，Otsuji T，et al.Expression of pigment epithelium derived factor and vascular endothelial growth factor in choroidal neovascular membranes and polypoidal choroidal vasculopathy［J］.Br J Ophthalmol，2004，88（6）：809－815.

［4］ 劉欣，王偉，王安茹，等.血氧濃度波動(dòng)致新生大鼠增生性視網(wǎng)膜病變的機(jī)制研究［J］.中華兒科雜志，2007，45（1）：7－13.