王靜 鐘聰敏 田西菊 王秀娟 程華

（1.河北省保定市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 保定 071000；2.河北省保定市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 保定 071000）

中青年腦梗死是指發(fā)病年齡在18～45歲的腦梗死。近年來，腦梗死人群有年輕化的趨勢。眾所周知，腦動(dòng)脈粥樣硬化是腦梗死的病理基礎(chǔ)，而早發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化是中青年腦梗死的重要病因［1］。動(dòng)脈粥樣硬化分子遺傳學(xué)的研究已從血脂水平深入到脂蛋白、載脂蛋白水平。載脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）是一種多態(tài)性蛋白，在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)多種與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的脂類代謝中均起關(guān)鍵作用，它通過多種途徑影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成。國內(nèi)關(guān)于apoE基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究已有報(bào)道［2－3］，但罕有對中青年人群中腦梗死與apoE基因多態(tài)性相關(guān)性的報(bào)道［4］。本課題研究了青年人群中apoE基因型的頻率及分布，以探討apoE基因多態(tài)性與中青年人群腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，對腦梗死的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河北省保定市第一醫(yī)院2010年9月—2012年9月被確診為腦梗死的110例漢族中青年住院患者作為中青年腦梗死組，平均年齡（35.0±9.5）歲，其中男性73例、女性37例。所有患者的診斷均符合第4屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，經(jīng)顱腦CT或MRI檢查確診。排除心源性、動(dòng)脈炎、脂肪栓子、藥物、腫瘤等引起的腦梗死和肝、腎及血液系統(tǒng)疾病，無抗凝及溶栓治療史。對照組為我院同期體檢的126例漢族中青年健康者，平均年齡（36.0±10.8）歲，其中男性86例、女性40例。采集標(biāo)本前均已明確告知并簽署知情同意書。2組年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取晨起空腹12～14 h的抗凝靜脈血3 mL，采用NaCl鹽析法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，－20℃保存。

1.2.2 試劑 抗凝劑、DNA提取試劑、紅細(xì)胞裂解液（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究室）；TE緩沖液、儲(chǔ)存液SDS、蛋白酶K（美國Sigma公司）；PCR試劑：4種dNTPs（Sigma公司），引物：上游引物序列5′－AACAACTGACCCCGGTG－GCG－3′和下游引物序列5′－ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC－3′，反應(yīng)引物按文獻(xiàn)［6］設(shè)計(jì)，由中山大學(xué)基因中心合成。10%二甲基亞砜、Taq DNA聚合酶（美國Sigma公司），10倍PCR緩沖液（美國Sigma公司）。電泳試劑：2%瓊脂糖凝膠、限制性內(nèi)切酶 HhaⅠ（美國Sigma公司）、限制性內(nèi)切酶緩沖液（美國Sigma公司）。

1.2.3 apoE基因的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增 擴(kuò)增apoE基因第4外顯子中含多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物長度299 bp。PCR反應(yīng)體系：基因組 DNA：0.5μg，4種dNTPs終濃度200μmol／L，引物終濃度0.2μmol／L，10%二甲基亞砜5μL，Taq DNA聚合酶2.5 U，10倍PCR緩沖液5μL，最后加水至終體積50μL。反應(yīng)體系用50μL石蠟油覆蓋，94℃預(yù)變性4 min；然后94℃變性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳時(shí)間1 h。溴化乙啶染色，在UV燈下發(fā)橘紅色熒光，檢測擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)299 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 apoE基因的限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析 取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，加入6 U HhaⅠ內(nèi)切酶及其緩 沖 液，加 雙 蒸 水 （double distillated water，ddH2O），使總體積達(dá)20μL，37℃消化4～5 h。將酶切產(chǎn)物于5%聚丙烯酰胺凝膠中，進(jìn)行8 V／cm垂直電泳，將電泳凝膠進(jìn)行溴化乙啶室溫染色40 min后水洗，紫外燈下觀察DNA帶型并攝影。按照Hixson等［7］的方法進(jìn)行apoE基因分型，根據(jù)3種等位基因特異性片段的不同，可在電泳圖譜上鑒定apoE基因不同的基因型。經(jīng)特異性限制內(nèi)切酶消化后apoE的PCR產(chǎn)物片段可能出現(xiàn)6種片段大小的組合：ε2／2為91、83、61 bp；ε3／3為91、61、48、35 bp，ε4／4為72、61、48、35 bp；ε2／3為91、83、61、48、35 bp；ε2／4為91、83、72、61、48、35 bp；ε3／4為91、72、61、48、35 bp。參考標(biāo)準(zhǔn)物根據(jù)長度片段確定待測樣品apoE基因型，見圖1。

1.2.5 基因型和等位基因頻率計(jì)算方法 基因型頻率＝基因型頻數(shù)／總例數(shù)；等位基因頻率采用平衡法：ε2＝ε2／2＋1／2（ε2／3＋ε2／4）；ε3＝ε3／3＋1／2（ε2／3＋ε3／4）；ε4＝ε4／4＋1／2（ε3／4＋ε2／4）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 apoE基因呈多態(tài)性 apoE基因有6種基因型，即3種純合子（ε2／2、ε3／3、ε4／4）和3種雜合子（ε2／3、ε3／4、ε2／4）。

圖1 apoE基因PCR－RFLP產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 2組患者apoE基因型頻率 2組患者apoE基因型分布以ε3／3多見，在健康對照組為66.7%，中青年腦梗死組為46.4%；2組ε3／3和ε4／4基因型頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），ε2／2、ε2／3、ε2／4和ε3／4基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

2.3 2組apoE等位基因頻率 2組ε3、ε4等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），ε2等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 中青年腦梗死組與對照組apoE基因型頻率比較［%（n）］

表2 中青年腦梗死組與對照組apoE等位基因頻率比較［%（n）］

3 討 論

apoE是血漿中重要的載脂蛋白之一，參與機(jī)體血脂代謝及調(diào)節(jié)膽固醇平衡，在動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。apoE的合成是由位于一個(gè)基因位點(diǎn)上的3個(gè)等位基因所控制，即ε2、ε3和ε4，每一個(gè)等位基因?qū)?yīng)于一個(gè)主要異構(gòu)體產(chǎn)生3種純合子（ε2／2，ε3／3，ε4／4）和3種雜合子（ε2／3，ε2／4，ε3／4）共6種常見表型，apoEε3／3型為野生型，ε2和ε4是由其變異而來。

apoE基因多態(tài)性具有種族差異，在對漢族人群apoE基因頻率研究中發(fā)現(xiàn)，各年齡組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ε3為最常見的等位基因。本研究結(jié)果顯示，在中青年人群對照組中ε3／3基因型最多（66.7%），ε3等位基因出現(xiàn)頻率均顯著高于ε2和ε4（P均＜0.05），與對漢族人基因頻率研究結(jié)果相一致［8］。

近年來，國內(nèi)外對apoE的基因多態(tài)性與腦梗死相關(guān)性的研究較多。Sheng等［9］通過對缺血再灌注小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，ε3轉(zhuǎn)基因鼠的神經(jīng)損害程度小于ε4轉(zhuǎn)基因鼠，提示ε3有助于腦梗死發(fā)病后的神經(jīng)修復(fù)。本研究以河北省保定地區(qū)漢族中青年人群為背景，也發(fā)現(xiàn)在腦梗死組ε4／4基因型頻率、ε4等位基因頻率顯著高于對照組（P＜0.05）；ε3／3基因型頻率、ε3等位基因頻率較對照組降低（P＜0.05），從而可以進(jìn)一步證實(shí)ε3等位基因是中青年腦梗死的保護(hù)性基因，而ε4等位基因可能是中青年腦梗死的一種遺傳易感因子［3－4］。但是也有研究［10－11］并未發(fā)現(xiàn)apoE基因多態(tài)性與腦梗死之間存在相關(guān)性。

中青年腦梗死最常見的危險(xiǎn)因素為高血壓病、吸煙、飲酒，其次為血脂異常、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥等，有研究［12－13］證實(shí)，apoE 基因多態(tài)性是影響2型糖尿病患者發(fā)病的一個(gè)重要遺傳因素，且2型糖尿病患者中ε4攜帶者具有較高的腦梗死易感性。ε4等位基因通過多種機(jī)制使血漿膽固醇水平增高，進(jìn)而導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生［14］。

總之，本研究認(rèn)為apoE基因多態(tài)性與中青年腦梗死密切相關(guān)，進(jìn)行apoE基因多態(tài)性分析對腦梗死的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療具有重要意義。

［1］ Lee TH，Hsu WC，Chen CJ，et al.Etiologic study of young ischemic stroke in Taiwan［J］.Stroke，2002，33（8）：1950－1955.

［2］ 王景華，寧憲嘉，盧紅艷，等.腦梗死患者載脂蛋白E基因多態(tài)性特點(diǎn)研究［J］.中國綜合臨床，2006，22（2）：118－120.

［3］ 王秀娟，王彥，王靜，等.保定市中老年人群載脂蛋白E基因多態(tài)性與腦梗死遺傳易感性關(guān)系的研究［J］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2009，3（12）：46－48.

［4］ 李作漢，劉衛(wèi)國，趙薛旭，等.中青年腦卒中的危險(xiǎn)因素及其載脂蛋白E基因多態(tài)性［J］.卒中與神經(jīng)疾病，2001，8（6）：326－329.

［5］ 中華神經(jīng)科學(xué)會(huì)，中華神經(jīng)外科學(xué)會(huì).各類腦血管病診斷要點(diǎn)［J］.中華神經(jīng)科雜志，1996，29（6）：379－380.

［6］ 時(shí)寶慶，呂全軍，李文杰，等.載脂蛋白E基因多態(tài)性與老年人血脂、血壓的相關(guān)性研究［J］.中國老年學(xué)雜志，2006，26（1）：19－21.

［7］ Hixson JE，Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaⅠ［J］.J Lipid Res，1990，31（3）：545－548.

［8］ 陳峰，薛雅麗，黃承濱，等.載脂蛋白E基因多態(tài)性在中國4個(gè)民族中的分布［J］.人類學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18（4）：311－315.

［9］ Sheng H，Laskowitz DT，Bennett E，et al.Apolipoprotein E isoform－specific differences in outcome from focal ischemia in transgenic mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1998，18（4）：361－366.

［10］ 陳衛(wèi)蓉，肖志杰，譚利民，等.載脂蛋白E基因多態(tài)性與老年冠心病和腦梗死的關(guān)系［J］.中華老年心腦血管病雜志，2005，7（2）：139－143.

［11］ Nakata Y，Katsuya T，Rakugi H，et al.Polymorphism of angiotensin converting enzyme，angiotensinogen，and apolipoprotein E genes in a Japanese population with cerebrovascular disease［J］.Am JHypertens，1997，10（12 Pt1）：1391－1395.

［12］ 郭金玲，李平，蘇作軍.ApoE基因多態(tài)性與2型糖尿病患者的相關(guān)性初步分析［J］.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，9（4）：532－534.

［13］ 韓峰，任建民，劉曉麗，等.載脂蛋白E基因多態(tài)性與2型糖尿病合并腦梗死的關(guān)系［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，46（5）：520－522.

［14］ Raffai RL，Dong LM，F(xiàn)arese RV Jr，et al.Introduction of human apolipoprotein E4"domain interaction"into mouse apolipoprotein E［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（20）：11587－11591.