李俊 王建中 黃新生 白廣平 童華

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院耳鼻咽喉科，上海 201700；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海 200032）

近年來發(fā)現(xiàn)，microRNAs（miRNAs）作為表觀遺傳修飾的手段和結(jié)果之一，很可能在人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中起著重要作用［1］。喉癌是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，目前其發(fā)病率有明顯增長趨勢，其中喉鱗癌占全部喉癌的93%～99%。本研究采用miRNAs芯片技術(shù)檢測喉鱗癌細(xì)胞株 Hep－2中miRNAs的表達(dá)，并采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime quantitative reverse－transcriptase polymerase chain reaction，RT－PCR）在喉鱗癌組織中驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 材料 20例喉鱗癌組織標(biāo)本及10例癌旁正常組織標(biāo)本均取自2010年7月—11月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院耳鼻咽喉科手術(shù)標(biāo)本。20例喉鱗癌病理診斷均為原發(fā)性喉鱗癌，所有患者均為首診首治，未行術(shù)前放化療。取材時(shí)，分別取癌旁正常組織（距癌組織大于3 cm）和癌組織，將組織塊剪至約1 cm大小，10 min內(nèi)迅速置于液氮中儲(chǔ)存，后轉(zhuǎn)至－80℃冰箱保存。喉鱗癌細(xì)胞株Hep－2及永生化正常人支氣管上皮細(xì)胞株HBEAs－2B均購自中國科學(xué)院上海生物所細(xì)胞庫。采用miRCURY LNATM U－niversal RT microRNA PCR芯片（丹麥Exiqon公司，由上?？党缮锕こ逃邢薰緳z測）；RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；SYBRTM Green master mix購自丹麥Exiqon公司；Taq聚合酶購自美國Promega公司；RNA酶抑制劑和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Epicentre公司；7900型PCR擴(kuò)增儀購自美國Applied Biosystem公司；目的基因及內(nèi)參引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；其他常規(guī)試劑購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep－2和 HBEAs－2B細(xì)胞均用RPMI 1640培養(yǎng)液（10%胎牛血清、100 U／mL青霉素及100μg／mL鏈霉素）于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每2～3 d換液，用0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RNA提取及質(zhì)量檢測 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，具體方法按說明書進(jìn)行。采用紫外分光光度計(jì)分別測定波長為230、260和280 nm處的吸光度值（A值），確定總RNA的純度和濃度；采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA樣品中28S RNA和18S RNA的比例，鑒定其純度和完整性。

1.2.3 miRNAs芯片檢測 采用 miRCURY LNATM Universal RT miroRNA PCR芯片，內(nèi)設(shè)6個(gè)內(nèi)參，包括3個(gè) miRNAs（hsa－miR－103、hsamiR－191和hsa－miR－423－5p）以及3個(gè)小RNA（U6、SNORD38B和SNORD49A）。采用Universal RT反應(yīng)，對Hep－2細(xì)胞及HBEAs－2B細(xì)胞進(jìn)行高通量miRNAs定量檢測。將總RNA樣品濃度調(diào)整至1.492～1.786 ng／μL，按以下20μL體系合成cDNA：5×反應(yīng)緩沖液4μL，酶混合液2μL，總RNA 14μL；反應(yīng)條件：42℃60 min，95℃5 min。cDNA稀釋100倍后，將cDNA模板與SYBRTM Green Master Mix按1∶1的比例混合，以每孔10 μL加入384孔PCR板中。采用7900型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃10 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；60℃1 min；分析溶解曲線。采用GenEx qPCR分析軟件（www.exiqon.com／mirnapcr－analysis）對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)和深入分析。

1.2.4 RT－PCR 檢測 miRNA－197（miR－197）在喉鱗癌組織中的表達(dá)水平 內(nèi)參U6引物序列：上游引物（F）為5′－GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT－3′； 下游引物 （R ）為 5′－CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT－3′；目的基因 miR－197引物序列：F為5′－GGTTCACCACCTTCTCCA－3′；R為5′－CAGTGCGTGTCGTGGAGT－3′。RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16℃30 min，42℃40 min，85℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物cDNA放在冰上待用或－20℃保存。RT－PCR反應(yīng)條件如下：95℃3 min；95℃15 s，60℃20 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)；78℃20 s。為了建立溶解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按95℃15 s、60℃20 s、72℃20 s、99℃15 s，從72℃緩慢加熱至99℃。各樣品中的miR－197和內(nèi)參U6分別進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用ΔΔCt方法，miRNA PCR Array計(jì)算公式：ΔΔCt＝ΔCt（Hep－2）－ΔCt（HBEAs－2B）；通過2－ΔΔCt計(jì)算 Hep－2與 HBEAs－2B對應(yīng)基因的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RNA質(zhì)檢結(jié)果 采用紫外吸收測定法測定從各細(xì)胞和組織樣本中分別提取的總RNA的濃度及純度，結(jié)果顯示，RNA純度和濃度均合格，A260／A280為1.8～2.1，A260／A230＞1.8，濃度為600～2500 ng／μL。變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果也提示，所提取RNA的濃度、純度和完整性均符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 miRNAs芯片結(jié)果 篩選條件為Fold Difference不低于2倍。與HBEAs－2B比較，Hep－2細(xì)胞中上調(diào)的miRNAs共166個(gè)，下調(diào)的miRNAs共47個(gè)。在 Hep－2細(xì)胞中，miR－197上調(diào)5.08倍，miR－133b上調(diào)21.79倍；miR－519d下調(diào)3.93倍，miR－20b下調(diào)21.49倍，經(jīng)組間t檢驗(yàn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。表達(dá)譜部分結(jié)果見表1。

2.3 RT－PCR檢測結(jié)果 miR－197在喉鱗癌組織及癌旁正常組織中的RT－PCR結(jié)果見圖1～4。目的基因miR－197和內(nèi)參基因U6的擴(kuò)增曲線從最大基線后開始出現(xiàn)指數(shù)增長期和平臺(tái)期，說明產(chǎn)物擴(kuò)增較好。目的基因miR－197和內(nèi)參基因U6的溶解曲線都只有單一銳利的峰，說明所設(shè)計(jì)的引物有較高特異性，只擴(kuò)增出單一產(chǎn)物。設(shè)置為由系統(tǒng)自動(dòng)調(diào)整基線和閾值，首先分別求出每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔中目的基因miR－197和內(nèi)參基因U6的平均Ct值，然后用內(nèi)參基因U6對各實(shí)驗(yàn)組樣本進(jìn)行校正（ΔCt），再取其對數(shù)，比較各樣本中 miR－197表達(dá)的差異，對對照組和實(shí)驗(yàn)組樣本的ΔCt進(jìn)行歸一化處理（2－△△Ct），最后根據(jù)2－△△Ct統(tǒng)計(jì)分析組間 miR－197的表達(dá)差異，見表2。結(jié)果顯示，miR－197在喉鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 Hep－2與HBEAs－2B中表達(dá)有差異的miRNAs譜

3 討 論

本研究采用miRNAs芯片技術(shù)檢測喉鱗癌細(xì)胞株Hep－2及正常人支氣管上皮細(xì)胞株HBEAs－2B中miRNAs的表達(dá)，首次獲得了喉鱗癌Hep－2細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜，從中挑選出在Hep－2中顯著高表達(dá)的miR－197，進(jìn)一步在20例喉鱗癌組織及10例癌旁正常組織中檢測其表達(dá)情況。本研究所用的丹麥Exiqon公司的miRCURY LNATM UniversalRT microRNA PCR芯片，實(shí)現(xiàn)了高通量高質(zhì)量的miRNAs定量檢測工作，采用一次單鏈cDNA合成反應(yīng)制備的cDNA可作為芯片所有miRNAs PCR反應(yīng)的模板，避免了用混合RT引物對擴(kuò)增特異性的影響，實(shí)現(xiàn)了引物Tm值均一；并能有效區(qū)分序列僅有一個(gè)堿基差異的miRNAs，還能區(qū)分成熟miRNAs和miRNAs前體；具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、質(zhì)控嚴(yán)格、高重復(fù)性的特點(diǎn)。

表2 RT－PCR檢測結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)，miR－197在人喉磷癌組織中表達(dá)水平顯著升高。Du等［2］研究發(fā)現(xiàn)，miR－197在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中表達(dá)水平高于人支氣管上皮細(xì)胞。Wong等［3］發(fā)現(xiàn)，miR－197、miR－184等24個(gè)miRNAs在舌鱗癌高表達(dá)，研究還發(fā)現(xiàn)，miR－184表達(dá)水平與舌鱗癌的發(fā)生有關(guān)。Nikiforova等［4］、Weber等［5］研究發(fā)現(xiàn)，miR－197在甲狀腺腫瘤中過表達(dá)，并且與其病理類型密切相關(guān)。Wang等［6］在婦女子宮肌瘤中發(fā)現(xiàn) miRNA－21、miR－197等高表達(dá)。Hamada等［7］發(fā)現(xiàn)，miR－197在人胰腺癌呈顯著性高表達(dá)。

綜上所述，miR－197在體內(nèi)外人喉鱗癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，揭示其可能在維持喉鱗癌細(xì)胞惡性表型中起重要作用，提示miR－197可能是喉鱗癌的特異性表達(dá)標(biāo)志物之一，為進(jìn)一步研究miR－197在喉癌中的作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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