孔凡志 李芳 周文華 周聯(lián)明 張光軍 黃忠明 張學(xué)利

(1.蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州 215123;2.上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院普外科，上海 201499)

近年研究［1］表明，腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的各個階段中都起著重要的作用。lumican是腫瘤微環(huán)境中一種特殊的細(xì)胞基質(zhì)蛋白，廣泛存在于人體組織間質(zhì)中，在黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤均有異常表達(dá)，但關(guān)于其在胃癌中的表達(dá)及臨床特點的研究較少［2］。本研究采用免疫組化及實時熒光定量PCR等方法觀察了lumican在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)，并探討了其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2004年12月—2008年1月在上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院手術(shù)治療并經(jīng)病理確診的胃腺癌患者144例，其中男性95例，平均年齡(63.4±27.2)歲;女性49 例，平均年齡(62.1 ±25.8)歲。根據(jù)TNM分期(UICC 1997):Ⅰ期30例，Ⅱ期49例，Ⅲ期57例，Ⅳ期8例。隨訪患者術(shù)后5年總生存率。切除40例胃癌患者標(biāo)本后即速凍于液氮，然后置于-80℃冰箱。樣本及資料收集經(jīng)上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實時熒光定量PCR檢測 采用Trizol試劑(日本Takara公司)抽提新鮮胃癌組織及癌旁正常黏膜組織RNA。引物序列(由上海生工生物工程公司合成):lumican上游5'-TGGAGGTCAATCAACTTGAGAA-3'，下游 5'-CAAACGCAAATGCTTGATC-TT-3';18s mRNA上游5'-TGCGAGTACTCAACACCAACA-3'，下游 5'-GCATATCTTCGGCCCACA-3'。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 30 s，PCR反應(yīng)95℃ 5 s、60℃ 31 s，40 個循環(huán)，結(jié)束95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。通過2-Ct［Ct=Ct(lumican)– Ct(18s mRNA)］來比較lumican mRNA的相對表達(dá)水平。

1.3 免疫組化染色 標(biāo)本經(jīng)二甲苯脫蠟，依次梯度乙醇脫水，3%H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉非特異性結(jié)合，滴加一抗lumican抗體，4℃過夜。復(fù)溫后滴加二抗，室溫孵育1 h后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)梯度乙醇脫水后，用中性樹脂膠封。由兩位病理專家對染色結(jié)果進(jìn)行評估，以lumican蛋白陽性反應(yīng)顆粒定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的染色強(qiáng)度和染色陽性細(xì)胞的百分比確定免疫組化結(jié)果。采用染色強(qiáng)度和染色陽性細(xì)胞百分比雙評分標(biāo)準(zhǔn)對蛋白表達(dá)進(jìn)行評估，(1)依據(jù)染色強(qiáng)度等級評分:無色為0分，淺黃或淺褐色為1分，棕黃或褐色為2分，深褐色為3分;(2)依據(jù)染色陽性細(xì)胞百分比評分:＜25%為1分，25% ～50%為2分，50% ～75%為3分，＞75%為4分;(3)以染色強(qiáng)度和染色陽性細(xì)胞百分比的評分總和評分:0～1分為陰性;2～4分為弱陽性;5～7分為強(qiáng)陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行χ2檢驗、單因素和多因素回歸分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank進(jìn)行假設(shè)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lumican蛋白在胃癌組織及癌旁正常黏膜組織的表達(dá) lumican在胃癌組織及癌旁正常黏膜組織的間質(zhì)中均可有表達(dá)，前者分布呈彌漫性或灶性，定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，陽性表達(dá)構(gòu)成比率為89.6%(129/144);后者陽性表達(dá)構(gòu)成比率為 8.3%(12/144)，且都為弱陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 lumican mRNA在胃癌組織及癌旁正常黏膜組織的表達(dá) lumican mRNA在40例胃癌組織中表達(dá)水平較癌旁正常黏膜組織明顯上調(diào)，上調(diào)約3.15倍(胃癌組織 lumican mRNA ΔCT=2.58 ±1.62，癌旁正常黏膜組織 lumican mRNA ΔCT=3.95 ±1.34)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 lumican mRNA在40例胃癌組織與癌旁正常黏膜組織的表達(dá)

2.3 lumican蛋白表達(dá)與臨床各病理參數(shù)的關(guān)系lumican表達(dá)水平與患者的性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、癌栓無相關(guān)性(P＞0.05);與浸潤深度(P ＜0.01)、腫瘤直徑(P ＜0.01)、腫瘤部位(P＜0.05)和 UICC分期(P＜0.05)明顯相關(guān)。lumican表達(dá)水平也與浸潤深度顯著相關(guān)，侵及深肌層組的表達(dá)水平顯著高于侵及淺肌層組。腫瘤直徑＞5 cm組表達(dá)水平顯著高于腫瘤直徑≤5 cm組，見表1。

2.4 lumican表達(dá)與術(shù)后生存率的關(guān)系 lumican強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性表達(dá)組的術(shù)后5年生存率分別為86.7%、46.9% 和 30.9%。Kaplan-Meier生存統(tǒng)計結(jié)果顯示，lumican表達(dá)在各組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.927，P ＜0.01)。單因素分析表明，性別、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、腫瘤部位、UICC分期、Lauren分型、脈管侵犯、癌栓和lumican表達(dá)水平是影響總體生存的因素，見表2。多因素COX模型分析顯示，lumican表達(dá)水平、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、UICC分期及脈管侵犯是影響總體生存的獨立預(yù)后因素，見表3。lumican表達(dá)強(qiáng)陽性組、弱陽性組與陰性組比較，強(qiáng)陽性組(RR=4.972，95%CI:1.110 ～20.822)和弱陽性組(RR=5.910，95%CI:1.399 ～24.922)胃癌病死風(fēng)險較高。

表1 lumican表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表2 影響胃癌患者術(shù)后總體生存率的單因素回歸分析

表3 影響胃癌患者術(shù)后總體生存率的多因素回歸分析

3 討 論

lumican蛋白屬于富含亮氨酸低分子蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan，SLRP)家族［1］。氨基酸序列研究表明，lumican核心蛋白(core protein)存在4個天冬氨酸殘基，能夠進(jìn)行N-糖基化，其糖基化水平取決于不同組織類型、發(fā)展階段和生理條件等。目前研究［3］發(fā)現(xiàn)，lumican在多種惡性腫瘤細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)中有異常表達(dá)，但關(guān)于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用有差異，如在小鼠黑色素瘤模型中其被證實可抑制腫瘤生長和進(jìn)展;在骨肉瘤研究中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與細(xì)胞分化呈正相關(guān)，和骨肉瘤細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)。此外，其在胰腺癌間質(zhì)中的高表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌的生長和侵襲，且患者生存期短［4］。

本研究結(jié)果顯示，lumican在胃癌組織中陽性表達(dá)率為89.6%，顯著高于癌旁正常黏膜組織(8.3%)，且mRNA和蛋白水平均增高，說明其表達(dá)上調(diào)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平，提示其可能是潛在的胃癌分子診斷標(biāo)記物。生存分析結(jié)果顯示，lumican表達(dá)陽性的患者術(shù)后總生存率降低;COX多因素回歸分析表明，lumican表達(dá)是胃癌患者術(shù)后預(yù)后不良的獨立危險因素，但表達(dá)調(diào)控機(jī)制等有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，lumican在胃癌組織中表達(dá)與患者的預(yù)后明確相關(guān)，其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、腫瘤直徑、腫瘤部位和UICC分期密切相關(guān)，lumican高表達(dá)患者預(yù)后不良，具有一定的潛在臨床意義。但其對胃癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移如何進(jìn)行調(diào)控以及具體途徑還有待進(jìn)一步研究。

［1］ Nikitovic D，Katonis P，Tsatsakis A，et al.Lumican，a small leucinerich proteoglycan［J］.IUBMB Life，2008，60(12):818-823.

［2］ Brézillon S，Pietraszek K，Maquart FX，et al.Lumican effects in the control of tumour progression and their links with metalloproteinases and integrins［J］.FEBS J，2013，208(10):2369-2381.

［3］ Nikitovic D，Berdiaki A，Zafiropoulos A，et al.Lumican expression is positively correlated with the differentiation and negatively with the growth of human osteosarcoma cells［J］.FEBS J，2008，275(2):350-361.

［4］ Ishiwata T，Cho K，Kawahara K，et al.Role of lumican in cancer cells and adjacent stromal tissues in human pancreatic cancer［J］.Oncol Rep，2007，18(3):537-543.