劉隨新，石 達， 陳建飛， 張 鑫，時洪艷，劉孝珍,2，張 莎,2，王 璐，馮 力*

（1.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001；2.東北農業(yè)大學，黑龍江哈爾濱 150030）

豬流行性腹瀉（Porcine epidem ic diarrhea，PED）是由PED病毒（PEDV）引起的一種急性高度接觸性腸道傳染病，以腸炎為主要特征，對仔豬致死率高達90%[1]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失。

PEDV屬于α冠狀病毒屬，基因組為具有感染性的單股正鏈RNA，5'端具有帽子結構，3'端具有Poly（A）序列。PEDV主要的結構蛋白包括：纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）和小膜蛋白（E）[2]。其中PEDV N蛋白是一種磷酸化的并富含堿性氨基酸的結構蛋白，可以定位于細胞的核仁中，同時推測N蛋白可能參與細胞核仁的功能調節(jié)，干擾宿主細胞的周期，從而為病毒的復制提供條件[3-5]。

本研究根據本實驗室前期工作鑒定的核仁定位信號，構建核仁定位信號缺失重組質粒pAc-GFP-dN，轉染Vero E6細胞，利用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞術觀察核仁定位信號缺失的N蛋白的定位情況和轉染細胞的周期變化，進而為N蛋白核仁定位信號對宿主細胞的影響提供了實驗依據，為進一步研究PEDV的致病機制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 重組質粒、菌株和細胞 含有編碼PEDV N基因的重組質粒pMD-N、真核表達載體pAc-GFP-C1、感受態(tài)E.coliDH5α和Vero E6細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 限制性內切酶、T4DNA連接酶購自美國NEB公司；PrimerSTAR HS DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Hyclone公司；質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；細胞培養(yǎng)板購自Greierbio-one公司。

1.3 重組質粒的構建及鑒定 根據PEDV CV777株 N基因的全序列設計引物 N1U、N1L、N2U、N2L。以N1U和 N2L引物[N1U：5'-CCCAAGCTT ACCATGGCTTCTGTCAGCTTTC-3'（HindⅢ），N2L：5'-GGGCGGGATCCTTAATTTCCTGTGTCGGAG-3'（BamHⅠ）]，擴增N基因，大小為1 326 bp。

核仁定位信號序列編碼區(qū)位于N基因的211 bp～270 bp，共60 bp，N基因中核仁定位信號上游序列命名為N1，大小為210 bp，PCR擴增引物為N1U和N1L（5'-CAGAAAACACCCTCAGTACGAGGTTGT TCAATTCGCTCAC-3'）；核仁定位信號下游序列命名為N2，大小為1 056 bp，PCR擴增引物為N2U（5'-GTGAGCGAATTGAACAACCTCGTACTGAGGG TGTTTTCTGG-3'）和N2L。將分別擴增的N1和N2按照凝膠回收試劑盒說明書進行凝膠回收，并以其為模板，以N1U和N2L為引物利用SOE-PCR的方法擴增核仁定位信號序列缺失基因dN。。

將PCR擴增產物dN和N基因采用凝膠回收，將兩種回收產物和pAC-GFP-C1載體分別進行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收酶切產物，按照5∶1的分子比例16℃連接過夜，轉化感受態(tài)E.coliDH5α，培養(yǎng)后，提取重組質粒，由上海英俊生物技術有限公司測序。

1.4 轉染Vero E6細胞 將重組質粒轉染于60%～80%融合度的無抗生素培養(yǎng)的Vero E6細胞中。按LipofectamineTM2000說明書進行細胞轉染。

1.5 共聚焦顯微鏡分析 重組質粒轉染48 h后，棄培養(yǎng)液，細胞用冰預冷的50%甲醇和50%丙酮的固定液室溫固定15 min，用PBS漂洗3次，每次5min，自然干燥，加入DAPI（100μg/mL），于4℃避光染核15 min，PBS漂洗3次，利用激光共聚焦顯微鏡分析核仁定位信號缺失后N蛋白在細胞內的定位情況。

1.6 流式細胞術檢測宿主細胞周期的變化 重組質粒轉染48 h后，棄培養(yǎng)液，用胰酶消化于1.5 ML離心管中，2 000 r/min 4℃離心5 min，PBS漂洗3次。按照說明書進行細胞的染核，利用流式細胞儀（FASCAria）檢測細胞周期的變化。

2 結 果

2.1 N基因和dN基因的擴增 以pMD-N為模板，利用設計的特異引物擴增得到與預期大小相符的dN和N基因（圖1）。

2.2 激光共聚焦顯微鏡分析dN蛋白在細胞中的定位情況 將pAc-GFP、pAc-GFP-N及pAc-GFP-dN分別轉染于Vero E6細胞中，48 h后，利用激光共聚焦顯微鏡分析。激光共聚焦顯微鏡圖片顯示，在轉染空載體pAc-GFP細胞中可以在細胞核質和細胞質中觀察到綠色熒光，在轉染pAc-GFP-N的細胞中，可以在細胞核仁及細胞質中觀察到綠色熒光，而在轉染pAc-GFP-dN的細胞中，則只能在細胞質中發(fā)現綠色熒光（圖2），結果表明核仁定位信號的缺失導致dN蛋白喪失了在細胞核仁中定位的能力。

圖1 dN和N基因擴增結果Fig.1 Amplification of N and dN genes by PCR

圖2 激光共聚焦分析dN蛋白在細胞漿中的定位結果Fig.2 The subcellular localization of the expressed dN protein in cytoplasm of the transfected Vero E6 cells by confocal Microscope observation

2.3 細胞流式儀檢測dN蛋白對細胞的周期變化影響 將pAc-GFP、pAc-GFP-N及pAc-GFP-dN分別轉染于Vero E6細胞中，48 h后，利用流式細胞儀檢測。結果表明，空白細胞對照組G0/G1期、S期及G2/M期細胞分別為60.4%、15.9%和10.1%；空載體對照組G0/G1期、S期及G2/M期細胞分別為58.1%、13.9%，13.4%；在轉染pAc-GFP-N細胞中G0/G1期、S期及G2/M期分別為57.9%、13.5%和20.5%，與空白細胞對照組，空載體對照組相比較顯示：G2/M期明顯增多。而轉染pAc-GFP-dN細胞中G2/M期細胞則與正常對照組細胞相似，G0/G1期為61.9%，S期為12.0%，G2M期為11.9%（圖3）。結果表明N蛋白可以調節(jié)細胞周期，使其在G2M期出現停滯現象，而核仁定位信號缺失之后，N蛋白喪失了使宿主細胞周期在G2/M期停滯的能力，表明N蛋白核仁定位信號在宿主細胞周期調節(jié)中起到重要作用。

圖3 流式細胞儀檢測dN蛋白對細胞周期影響結果Fig.3 Effection of the expressed dN protein on cell cycle by Flow Cytometry

3 討 論

N蛋白為冠狀病毒的主要結構蛋白之一，由377個至455個氨基酸組成，以具有高等電點、高絲氨酸含量為特征，是一種多功能的磷酸化蛋白，與病毒基因組RNA相互纏繞形成核衣殼，有6個～7個潛在的磷酸化位點，3個相對保守的結構域，位于中間的一個結構域能夠與病毒的RNA前導序列結合，在病毒RNA合成過程中發(fā)揮著重要的作用。在感染病毒細胞中，N蛋白是表達量最高的病毒蛋白之一[6-8]。

作為單股正鏈RNA病毒，PEDV可以在宿主細胞的細胞質中完成所有的復制過程，但研究表明，在宿主細胞的細胞核中也可以發(fā)現病毒的N蛋白，這表明N蛋白中存在引導蛋白到細胞核中定位的信號，N蛋白借助這些信號和載體蛋白相互作用從而進入細胞核。大量的研究表明N蛋白借助核（核仁）定位信號轉移到細胞核仁中參與細胞分離期的調節(jié)，從而有利于病毒的復制。Chen等研究推斷人呼吸系統冠狀病毒（SARS-CoV）N蛋白與核仁蛋白和纖維蛋白相互作用，使其重新分布，并抑制細胞的分裂[9]，Wurm等推定鼠肝炎病毒和豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白可能延遲細胞周期來創(chuàng)造有利病毒復制的適宜條件[10-13]。

本研究根據本實驗室前期鑒定的核仁定位信號，即位于N基因的核苷酸序列的第211位～270位，共60個核苷酸，利用激光共聚焦顯微鏡觀察，確定缺失核仁定位信號的N蛋白喪失了在細胞核仁中定位的功能；并進行流式細胞儀的檢測，可觀察到轉染含有完整核仁定位信號的N蛋白后，宿主細胞在G2/M期明顯增加，而轉染缺失核仁定位信號的dN蛋白的細胞，與正常細胞相似，在G2/M期無明顯增加的現象。這與其他冠狀病毒N蛋白對宿主細胞周期的影響相似，表明N蛋白通過在核仁中定位來調節(jié)宿主細胞的周期變化，從而有利于病毒在其體內的復制。同時對核仁定位信號的初步分析為進一步研究PEDV致病機制的闡明和基因疫苗的研制提供了新的依據。

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