韓 陽，郝志超，王 琪，王文飛，趙景壯，郭 茉，吳云舟，葉賢龍，任桂萍，李德山

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥教研室，黑龍江哈爾濱 150030）

犬細(xì)胞因子特別是干擾素（IFN）的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性等作用在犬病治療中引起廣泛關(guān)注。DevosK等克隆了犬 IFN-γ（CaIFN-γ）基因[1]，楊琪等克隆了CaIFN-γcDNA，并用pRC/CMV2表達(dá)載體在鼠骨髓瘤細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)[2]，但真核表達(dá)產(chǎn)量很低，陳忠廣等探索了以包涵體形式表達(dá)的CaIFN-γ蛋白的稀釋復(fù)性的條件[3]，但包涵體需經(jīng)過重新折疊復(fù)性才能夠獲得其原有的生物活性，這使犬CaIFN-γ不能大量地應(yīng)用于臨床試驗，所以獲得高產(chǎn)量并且具有活性的CaIFN-γ蛋白是目前急需解決的關(guān)鍵問題。本實驗利用SUMO（Small ubiquitin-like modifier-1）表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了可溶性的CaIFN-γ蛋白，SUMO可以作為分子伴侶來增加外源蛋白的穩(wěn)定性和可溶性，其作用機(jī)理可能是SUMO蛋白作為一個高度疏水的核心，為目的蛋白的折疊提供成核位點(diǎn)，促進(jìn)蛋白間的相互作用并使其正確折疊，最終增強(qiáng)了融合蛋白的可溶性[4]。本研究通過引入伴侶分子SUMO，實現(xiàn)CaIFN-γ蛋白的可溶性表達(dá)，并獲得具有高生物學(xué)活性的IFN-γ蛋白，從而解決IFN-γ包涵體蛋白復(fù)性效率低，并且生物學(xué)活性差的問題。

1 材料和方法

1.1 載體、細(xì)胞株及菌株 pMD18-T載體購自TaKaRa公司；pSUMO expression質(zhì)粒由本實驗室保存；犬腎（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細(xì)胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病教研室提供；E.coliDH5α、E.coliRosetta（DE3）pLysS由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑購自Invitrogen公司；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；SUMO ProteaseⅠ由本實驗室表達(dá)純化；Real time PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的CaIFN-γ （NM_001003174.1）設(shè)計引物。

CaIFN-γ-f： 5'-GGTCTCAAGGTCAGGCCATGT TTTTTAAAGAAATAG-3'（BsaⅠ ）； CaIFN-γ-r： 5'-C GCGGATCCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAA ACAGAT-3'（BamHⅠ）

P53-f： 5'-TTGCCAGCTGGCGAAGACCTG-3'；P53-r：5'-ACCTCGGGTGGCTCATAAGGCA-3'

GAPDH-f：5'-TGCCGCCTGGAGAAAGCTGC-3'；GAPDH-r：5'-TCCCAGGAAATGAGCTTGAC-3'

1.4 目的基因的克隆與序列測定 取人工感染犬瘟熱病毒（CDV）的成年犬脾臟，采用淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞，提取其總RNA。以其為模板，Oligo（dT）18為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增CaIFN-γ基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電檢測。采用凝膠回收試劑盒回收并純化目的DNA，連入pMD18-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDCaIFN-γ，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。采用凝膠回收試劑盒回收并純化目的DNA，連入pSUMO載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pSUMOCaIFN-γ。

1.5 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將pSUMO-CaIFN-γ轉(zhuǎn)化Rosetta（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)至OD600nm達(dá)0.3～0.4時，加IPTG至終濃度為0.25mmol/L誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。將不同誘導(dǎo)時間的誘導(dǎo)菌經(jīng)超聲儀破碎菌體，分離上清及沉淀，分別進(jìn)行SDSPAGE分析表達(dá)蛋白的可溶性。

1.6 重組蛋白的純化 誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體離心后用裂解緩沖液懸浮，超聲裂解離心，將上清液通過0.45μm濾膜過濾后，按AKTA purifier 100-純化系統(tǒng)操作說明書的方法純化融合蛋白，加入SUMO ProteaseI和終濃度為2 mmol/L的DTT，4℃過夜消化，切除SUMO融合標(biāo)簽。酶切產(chǎn)物再通過His TrapTMFF crude column親和層析柱分離純化，收集紫外吸收峰處的流穿液，即為成熟蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.7 Ca IFN-γ蛋白對MDCK細(xì)胞生長的抑制試驗將純化后的CaIFN-γ（0.1 mg/mL）蛋白按1∶5倍比稀釋后加入于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板經(jīng)24 h培養(yǎng)的MDCK單層細(xì)胞各孔中，共設(shè)5個梯度，每個濃度梯度設(shè)5個復(fù)孔，設(shè)空白對照（不加CaIFN-γ蛋白）及陰性對照（加入CaIFN-γ蛋白緩沖液）。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h、72 h后，每孔加20μL MTT（5 mg/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，向每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 Min，酶標(biāo)儀檢測OD490nm值，以系統(tǒng)空白組（只加DMSO組）的平均值調(diào)零，按以下公式計算抑制率：

細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%

1.8 實時熒光定量PCR檢測內(nèi)源p53的表達(dá) 將處于對數(shù)生長期的MDCK犬腎細(xì)胞，1×106/mL接種于六孔板，用純化后的CaIFN-γ蛋白進(jìn)行刺激，分別將蛋白（0.1 mg/mL）進(jìn)行10倍、100倍、1 000倍稀釋，刺激4 h，real time PCR檢測CaIFN-γ刺激下，p53表達(dá)情況；同時將CaIFN-γ蛋白100倍稀釋后，與MDCK細(xì)胞分別作用2 h、4 h、6 h，檢測p53表達(dá)情況。以GAPDH作為內(nèi)參，以未加CaIFN-γ蛋白刺激的空白細(xì)胞作為對照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本的t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Ca IFN-γ基因擴(kuò)增及序列分析 CaIFN-γ基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約400 bp處可見特異性DNA片段，大小與預(yù)期相符（圖1）。測序結(jié)果與GenBank中登錄的CaIFN-γ基因序列的同源性達(dá)100%。pSUMO-CaIFN-γ經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約400 bp處均可見特異性DNA片段，大小與預(yù)期相符（432 bp）。

圖1 PCR擴(kuò)增CaIFN-γ基因Fig.1 Amplification of CaIFN-γgene by PCR

2.2 重組成熟Ca IFN-γ蛋白的制備 采用SUMO系統(tǒng)表達(dá)SUMO-CaIFN-γ融合蛋白，將表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，并且取不同誘導(dǎo)時間的誘導(dǎo)菌進(jìn)行SDS-PAGE分析?；叶确治鼋Y(jié)果顯示，上清中CaIFN-γ蛋白總量占菌體蛋白總量的70%，目的蛋白為可溶性表達(dá)（圖2），誘導(dǎo)后6 h，目的蛋白表達(dá)量達(dá)到高峰。利用SUMO系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白時，融合蛋白N端含有6×His標(biāo)簽，可以利用Ni-NTA層析柱進(jìn)行純化。表達(dá)菌破碎后取上清經(jīng)親和層析得到唯一的洗脫峰即為SUMO-CaIFN-γ融合蛋白。融合蛋白經(jīng)SUMO ProteaseⅠ酶切純化后獲得成熟CaIFN-γ 蛋白（圖 3）。

圖2 CaIFN-γ在SUMO表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of SUMO-CaIFN-γfusion protein expression in E.coli

圖3 CaIFN-γ純化蛋白SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified CaIFN-γ

2.3 重組Ca IFN-γ蛋白對MDCK增殖的抑制作用將純化后的重組CaIFN-γ蛋白按1∶5倍比稀釋后加入各孔。測定吸光度并計算細(xì)胞生長抑制率，以各孔所加CaIFN-γ蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞生長抑制率為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果顯示，與蛋白緩沖液對照組相比純化后的重組CaIFN-γ對MDCK細(xì)胞生長存在明顯的抑制作用（p<0.05），隨著CaIFN-γ濃度增加，對MDCK細(xì)胞抑制率逐漸增加，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹? 250 ng/mL時，達(dá)到最大抑制率72%，并且72 h后的抑制率明顯大于48 h（p<0.05）（圖4）。

2.4 Ca IFN-γ上調(diào)MDCK細(xì)胞p53 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 在CaIFN-γ蛋白的刺激下，MDCK內(nèi)源的p53的表達(dá)水平在4 h達(dá)到最高并且是對照組的399倍（圖5）；并且隨著IFN-γ劑量的不斷增加，p53的mRNA水平也具有逐漸增加的趨勢，呈劑量依賴性關(guān)系，差異顯著（p<0.05）（圖6）。

圖4 CaIFN-γ對MDCK細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.4 The inhibition of proliferation of MDCK cells by CaIFN-γ

圖5 CaIFN-γ刺激p53表達(dá)的時間依賴性Fig.5 Time-dependent expression of p53 in MDCK cells after stimulation with CaIFN-γ

3 討 論

原核系統(tǒng)表達(dá)的INF多以包涵體形成存在，需要通過變性復(fù)性后才能恢復(fù)其生物活性。雖然陳忠廣等建立較好的CaIFN-γ蛋白包涵體復(fù)性方法，但包涵體復(fù)性終究是一個費(fèi)時、費(fèi)力的過程，而且容易使溶解后的蛋白質(zhì)失去某些生物功能或全部失活，影響對CaIFN-γ的進(jìn)一步研究及應(yīng)用。因此，采用一個合適的原核表達(dá)系統(tǒng)對提高CaIFN-γ的可溶性表達(dá)尤為重要。本研究可溶性表達(dá)目的蛋白，獲得具有生物活性的CaIFN-γ。近年來，研究表明SUMO可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、顯著增加重組蛋白表達(dá)量以及促進(jìn)靶蛋白正確折疊、提高可溶性等功能[5]。本研究采用SUMO可溶系統(tǒng)高效穩(wěn)定的表達(dá)了可溶的CaIFN-γ蛋白，IPTG誘導(dǎo)后收集菌體，破碎后SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)量，上清中蛋白含量占菌體蛋白總量的70%，這與以往利用其它表達(dá)載體表達(dá)CaIFN-γ相比，大大提高了蛋白的可溶性表達(dá)，為CaIFN-γ的研究及大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

圖6 CaIFN-γ刺激p53表達(dá)劑量依賴性Fig.6 Dose-dependent expression of p53 in MDCK cells after stimulation with CaIFN-γ

IFN對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的分裂均有明顯的抑制作用[6-7]。如IFN-α抑制堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而IFN-α和IFN-γ均可以直接抑制人表皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[8]。因此，我們采用MTT方法以不同濃度，不同作用時間檢測INF-γ對永生化的細(xì)胞MDCK的增殖抑制作用，結(jié)果表明CaIFN-γ蛋白顯著抑制該細(xì)胞的增殖。

Moiseeva等人研究表明IFN-β作用于人的成纖維細(xì)胞，可以通過DNA損傷和激活p53信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[9]，Akinori等人研究表明，IFN-α作用于鼠胚胎成纖維細(xì)胞，IFN誘導(dǎo)生成的ISGF3可以與p53的ISRE結(jié)合，誘導(dǎo)p53上調(diào)表達(dá)，并且p53的表達(dá)量與時間和劑量呈依賴性關(guān)系[10]。Kim等人研究表明IFN-γ通過p53信號通路在誘導(dǎo)細(xì)胞衰老過程中起重要作用[11]。以上研究表明p53信號通路在IFN抑制細(xì)胞增殖并引起細(xì)胞衰老的過程中起重要作用。本文采用CaIFN-γ蛋白刺激MDCK細(xì)胞，結(jié)果表明MDCK細(xì)胞所表達(dá)的p53水平與INF-γ呈劑量依賴性，并且差異顯著，表明采用SUMO原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的INF-γ具有生物活性。

綜上所述，本研究采用SUMO表達(dá)系統(tǒng)，高效穩(wěn)定的表達(dá)了可溶性的CaIFN-γ蛋白，解決了包涵體變性復(fù)性影響蛋白活性和減少蛋白產(chǎn)量的瓶頸問題。通過MTT法檢測CaIFN-γ蛋白對MDCK細(xì)胞增殖的抑制作用，并通過real-time PCR檢測CaIFN-γ蛋白刺激后MDCK細(xì)胞內(nèi)源p53 mRNA表達(dá)量上調(diào)來鑒定CaIFN-γ的生物活性，建立了安全、快速、靈敏的INF活性檢測平臺，為高表達(dá)具有高活性的犬INF-γ，發(fā)掘其藥物價值和臨床價值奠定基礎(chǔ)。

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