朱 超 陳思禮

（中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074）

藻膽蛋白是藍(lán)藻中一種捕光色素蛋白，由藻膽色素（Phycobilin）與其相應(yīng)的脫輔基蛋白中保守性半胱氨酸的巰基以硫醚鍵共價(jià)結(jié)合而成.藻藍(lán)蛋白只有在結(jié)合了色基的情況下才有光學(xué)活性，而色基連接到脫輔基蛋白半胱氨基酸上需要色素裂合酶的催化［1－3］.定點(diǎn)突變能夠通過(guò)改變特定的氨基酸獲得突變蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，從微觀水平上闡明正常狀態(tài)下基因的調(diào)控機(jī)理、疾病的病因和機(jī)理［4］.可以利用定點(diǎn)突變對(duì)合成藻膽蛋白基因進(jìn)行改造，以便深入了解光合作用中各種藻膽蛋白捕獲和傳遞光能的精細(xì)機(jī)制［5］.藻藍(lán)蛋白不僅可作為熒光探針用于免疫檢測(cè)、熒光顯微術(shù)和流式細(xì)胞儀技術(shù)，作為光敏劑用于光動(dòng)力治療癌癥等方面，還具有提高機(jī)體免疫力、抗氧化，防治腫瘤等多種生理活性［6－9］.

通過(guò)BLAST 軟件同源性分析，從集胞藻PCC 6803中發(fā)現(xiàn)與裂合酶編碼基因cpeS具有同源性的基因slr2049.本實(shí)驗(yàn)利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建slr2049的8個(gè)突變體，以研究這8個(gè)氨基酸位點(diǎn)對(duì)酶催化活性的影響，確定哪些氨基酸在slr2049 酶催化活性中起到關(guān)鍵作用，從而為slr2049結(jié)構(gòu)和功能的研究提供相關(guān)信息.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

集胞藻PCC6803購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生所藻種庫(kù)，大腸桿菌E.coli，DH5α，BL21（DE3）菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pBluescipt II SK（＋），表達(dá)載體pCDFDuet－1 為本實(shí)驗(yàn)室保存，表達(dá)載體pET－23a（＋）由華中師范大學(xué)生科院惠贈(zèng).限制性內(nèi)切酶Pst I、Sal I、EcoR I和Xho I，T4DNA 連接酶，DL2000，DL5000，TaKaRa MutanBEST Kit定點(diǎn)突變?cè)噭┖芯鶠門aKaRa產(chǎn)品.DL250 購(gòu)于武漢力博瑞生物科技有限公司.DNA 回收試劑盒，質(zhì)粒小量快速提取試劑盒均為Axygen 公司產(chǎn)品.Taq酶、蛋白Marker為Fermentas公司產(chǎn)品.親和層析介質(zhì)購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1slr2049、ho1、cpcB、pcyA4 個(gè)基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI提供的基因序列，利用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，并在上下游引物分別引入酶切位點(diǎn)（下劃線部分），分別由南京金斯瑞生物科技有限公司和擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成.

提取的集胞藻PCC6803 總DNA 為模板，利用上述引物進(jìn)行Touch－down PCR 擴(kuò)增4 個(gè)基因.slr2049、ho1 和cpcB的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃1 min，55℃～52℃（每循環(huán)降0.5℃）1min，72℃2min循環(huán)10次；94℃1min，52℃1min，72℃2min循環(huán)20次；72℃10min.pcyA 的PCR 擴(kuò)增程序：94℃5 min；94℃1 min，60℃～50℃（每循環(huán)降0.5℃）1 min，72℃2 min循環(huán)20次；94℃1min，50℃1min，72℃2min循環(huán)15次；72℃10min.

1.2.2 4個(gè)基因的克隆 4個(gè)PCR 目的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，連接pBluescript II SK（＋）載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，挑取菌落培養(yǎng)于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)菌落PCR、雙酶切重組質(zhì)粒鑒定，送南京金斯瑞測(cè)序驗(yàn)證.

1.2.3slr2049突變體的構(gòu)建 將slr2049 的蛋白序列與已經(jīng)報(bào)道的6種色素裂合酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，得到22 個(gè)相同的位點(diǎn).以構(gòu)建的克隆載體pBlue－slr2049野生型為模板，設(shè)計(jì)引物（下劃線是突變位點(diǎn)），使用定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變.操作過(guò)程參照試劑盒使用說(shuō)明書.引物由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，測(cè)序驗(yàn)證.

1.2.4 表達(dá)載體pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA的構(gòu)建、蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化EcoRⅠ與PstⅠ分別雙酶切克隆載體pBlue－cpcB和pCDFDuet－1原核表達(dá)載體，EcoRⅠ與SalⅠ分別雙酶切克隆載體pBlue－h(huán)o1 和pET－23a（＋）原核表達(dá)載體，回收片段、連接、轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，分別用鏈霉素及氨芐青霉素抗性篩選，測(cè)序驗(yàn)證.

PstⅠ和SalⅠ分別雙酶切克隆載體pBlueslr2049野生型、pBlue－slr2049突變體和重組子pCDF－cpcB，SalⅠ和XhoⅠ分別雙酶切克隆載體pBlue－pcyA和重組子pET－h(huán)o1，重復(fù)上述過(guò)程.

培養(yǎng)過(guò)夜的重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA分別以1∶50接種于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.4～0.6，加IPTG（終濃度分別為（0.6mmol／L和0.8mmol／L）、28℃誘導(dǎo)表達(dá)10h；同時(shí)用未加IPTG的重組菌和含pCDFDuet－1及pET－23a（＋）空載體的BL21（DE3）菌為對(duì)照.離心收集細(xì)胞，含重組子的細(xì)胞重懸于超聲波緩沖液中（pH7.0），超聲6min，離心得到上清和沉淀，ddH2O稀 釋，加 上樣緩沖液、β－巰基乙醇煮沸6min，進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè).

1.2.5 重組藻藍(lán)蛋白β亞基的體內(nèi)合成及蛋白誘導(dǎo) pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體分別和pET－h(huán)o1－pcyA共轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞中，含有鏈霉素和氨芐青霉素的雙抗平板進(jìn)行篩選，挑取菌落培養(yǎng)于含鏈霉素和氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜.

將培養(yǎng)過(guò)夜的共轉(zhuǎn)化重組菌以1∶50接種于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.4～0.6，加IPTG（終濃度為1mmol／L）、20℃誘導(dǎo)表達(dá)12h；同時(shí)用未加IPTG的共轉(zhuǎn)化重組菌和含pCDFDute－1及pET－23a（＋）空載體的BL21（DE3）菌為對(duì)照.處理同上，進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)重組蛋白.

1.2.6 重組藻藍(lán)蛋白β亞基表達(dá)和純化 培養(yǎng)過(guò)夜的共轉(zhuǎn)化重組菌以1∶20接種于含雙抗的1.1L LB 培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.4～0.6，加IPTG（終濃度為1mmol／L）、20℃誘導(dǎo)表達(dá)12h；離心收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸于LE buffer（50mmol NaH2PO4，300mmol NaCl，pH 8.0），超聲破碎40min，離心得到上清，參照親和層析說(shuō)明書操作，得到的蛋白樣品用SDS－PAGE檢測(cè).

1.2.7 光譜測(cè)定 吸收光譜用UW757CRT 型紫外可見分光光度計(jì)，紫外可見光譜掃描范圍300～800nm，掃描速度960nm／min，狹縫寬度1.0nm；熒光光譜用F－2500熒光光度計(jì)，熒光光譜掃描速度1500nm／min，狹縫寬度5.0nm.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 slr2049、ho1、cpcB、pcyA4個(gè)基因的克隆與鑒定

以集胞藻Synechocystissp.PCC 6803基因組DNA 為模板，P1－P8引物分別擴(kuò)增出基因slr2049、cpcB、ho1、pcyA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到4個(gè)條帶和NCBI上已知基因大小分別是579bp，519bp，723bp，747bp相符.回收擴(kuò)增的產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化得到重組質(zhì)粒，采用菌落PCR 及限制性內(nèi)切酶雙酶切作進(jìn)一步鑒定（圖1），通過(guò)測(cè)序證明得到了目的條帶.

圖1 4個(gè)基因的PCR 產(chǎn)物，pBlue－slr2049野生型、pBlue－cpcB、pBlue－pcyA、pBlue－h(huán)o1 雙酶切鑒定圖譜Fig.1 PCR products of the four genes and Enzymatic cleavage analysis of pBlue－slr2049、pBlue－cpcB、pBlue－pcyA、pBlue－h(huán)o1

2.2 slr2049突變體鑒定

以pBlue－slr2049野生型為模板，采用定點(diǎn)突變引物P9－P24擴(kuò)增突變基因，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR，PstⅠ、SalⅠ雙酶切和測(cè)序鑒定，證明突變體構(gòu)建成功（圖2）.

2.3 重組表達(dá)載體pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA 構(gòu)建與表達(dá)

重組質(zhì)粒pBlue－cpcB、pBlue－h(huán)o1經(jīng)雙酶切并回收基因后亞克隆到原核表達(dá)載體pCDFDuet－1、pET－23a（＋），構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCDF－cpcB、pET－h(huán)o1.克隆質(zhì)粒pBlue－slr2049 野生型、pBlueslr2049突變體以及pBlue－pcyA 經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶雙酶切，重復(fù)上述操作.成功構(gòu)建重組表達(dá)載 體pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA.

圖2 8個(gè)slr2049突變體PCR 和pBlue－slr2049突變體雙酶切鑒定圖譜Fig.2 PCR products of the eight slr2049mutants and Enzymatic cleavage analysis of pBlue－slr2049mutants

圖3 表達(dá)載體雙酶切鑒定圖譜Fig.3 Enzymatic cleavage analysis of expression vector

重組表達(dá)質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049 野 生 型 和突變體以及pET－h(huán)o1－pcyA 轉(zhuǎn)化E.coli后，篩選陽(yáng)性重組子，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá).SDS－PAGE 分析表達(dá)產(chǎn)物（圖4），可以看出，目的蛋白的大小與預(yù)期的蛋白分子量吻合.CpcB、Slr2049野生型、Slr2049突變體和PCB合成酶表達(dá)成功.

圖4 pCDF－cpcB－slr2049野生型和pET－h(huán)o1－pcyA 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE電泳圖Fig.4 Analysis of expressed products of pCDF－cpcBslr2049and pET－h(huán)o1－pcyA SDS－PAGE

2.4 重組藻藍(lán)蛋白β亞基的體內(nèi)合成及蛋白誘導(dǎo)、純化和光譜分析

將重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049野生型和突變體分別與pET－h(huán)o1－pcyA共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）后，篩選陽(yáng)性重組子，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，得到共轉(zhuǎn)化菌株，冷凍離心收集菌體后，發(fā)現(xiàn)含有野 生型重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049 和 突 變 體重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049（H21S）／slr2049（L23S）／slr2049（F25S）／slr2049（W72L）／slr2049（G84S）／slr2049（Y124）的菌體沉淀均呈藍(lán)綠色，而含有突變體重組質(zhì)粒pCDF－cpcB－slr2049（A24S）／slr2049（R107S）的轉(zhuǎn)化菌體沉淀沒(méi)有藍(lán)綠色.鎳柱純化，SDS－PAGE檢測(cè)目的蛋白與預(yù)測(cè)大小一致（圖5）.

將純化的重組蛋白用紫外可見分光光度計(jì)和熒光光譜儀檢測(cè)吸收光譜.從吸收光譜和熒光光譜可知，野生型slr2049 和突變體slr2049（H21S）／slr2049（L23S）／slr2049（F25S）／slr2049（W72L）／slr2049（G84S）／slr2049（Y124S）能催化PCB 正確偶聯(lián)到CpcB上，產(chǎn)物的最大吸收峰和熒光發(fā)射峰分別在623nm 和640nm 左右，與天然產(chǎn)物最大吸收峰和熒光發(fā)射峰分別在625nm 和645nm 相近.而突變體slr2049（A24S）／slr2049（R107S）所催化的產(chǎn)物沒(méi)有出現(xiàn)最大吸收峰和熒光發(fā)射峰.突變體slr2049（L23S）／slr2049（W72L））／slr2049（G84S）所催化的產(chǎn)物雖然有吸收峰，但是吸收峰處的最大值與野生型slr2049催化的產(chǎn)物的吸收峰值相比明顯要小很多.

圖5 SDS－PAGE檢測(cè)純化的pET－h(huán)o1－pcyA－cpcB－slr2049野生型和pET－h(huán)o1－pcyA－cpcB－slr2049突變體表達(dá)產(chǎn)物Fig.5 Examination of purified pET－h(huán)o1－pcyA－cpcB－slr2049and pET－h(huán)o1－pcyA－cpcB－slr2049mutants with SDS－PAGE

圖6 體內(nèi)合成的重組藻藍(lán)蛋白β亞基紫外吸收光譜Fig.6 Absorption spectra of phycocyaninβ－subunit obtained by in vivo reconstitution

圖7 體內(nèi)合成的重組藻藍(lán)蛋白β亞基熒光光譜Fig.7 Fluorescence spectra of phycocyaninβ－subunit obtained by in vivo reconstitution

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從構(gòu)建突變體、表達(dá)載體、蛋白表達(dá)、SDS－PAGE凝膠電泳以及光譜掃描的結(jié)果，可以說(shuō)明slr2049所編碼的蛋白具有色素裂合酶的功能，同時(shí)也了解了slr2049的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及這些結(jié)構(gòu)與蛋白slr2049 在功能上的關(guān)系.光譜圖上，野生型slr2049和突變體slr2049（H21S）、slr2049（L23S）、slr2049（A24S）、slr2049（F25S）、slr2049（W72L）、slr2049（G84S）、slr2049（R107S）、slr2049（Y124S）之間有光譜吸收峰值差異，說(shuō)明這8個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)催化生成藻藍(lán)蛋白β亞基的能力也是有差異的.第24、107位丙氨酸和精氨酸突變所催化的表達(dá)產(chǎn)物在光譜圖上無(wú)光譜特性，可知沒(méi)有藻藍(lán)蛋白β亞基生成；證明24、107位的丙氨酸和精氨酸是必需氨基酸，是色素裂合酶的酶活中心，這兩個(gè)氨基酸的突變可以使色素裂合酶失活，喪失催化能力.第21、25、124位的組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸突變所催化的表達(dá)產(chǎn)物從光譜圖可知，它們有和野生型slr2049相差不大的吸收峰，說(shuō)明有藻藍(lán)蛋白β亞基生成；證明21、25、124位的組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸對(duì)色素裂合酶的催化作用無(wú)明顯影響，不是必需氨基酸.第23、72、84位的亮氨酸、色氨酸和甘氨酸突變所催化的表達(dá)產(chǎn)物從光譜圖可知，它們雖然有吸收峰，但是吸收峰處的最大值與野生型slr2049最大值相比明顯要小，說(shuō)明有藻藍(lán)蛋白β亞基生成，但蛋白重組效率不高；證明23、72、84位的亮氨酸、色氨酸和甘氨酸是色素裂合酶催化作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，這3個(gè)氨基酸的突變能影響它的活性，降低它的催化能力.造成這一差異可能原因是氨基酸的定點(diǎn)突變能造成蛋白的結(jié)構(gòu)和溶解性改變，從而影響了蛋白的催化能力.而對(duì)于其余的高保守的氨基酸位點(diǎn)是否是該蛋白酶的必需氨基酸和酶活性中心或是催化關(guān)鍵位點(diǎn)，待在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步的研究.

藻膽蛋白的獲得主要通過(guò)從藻類中提取的途徑，若采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)此種蛋白，必須先了解生成藻藍(lán)蛋白的機(jī)制，才能利用基因工程技術(shù)獲得大量藻膽蛋白，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效應(yīng).唐志紅等［10］、趙方慶等［11］在大腸桿菌中高效表達(dá)了藍(lán)藻別藻藍(lán)蛋白基因，并能大量生產(chǎn)高純度重組別藻藍(lán)蛋白——鐳普克（recombinantallophycocyanin，rAPC），試驗(yàn)證明這一產(chǎn)物有良好的抗腫瘤活性和免疫能力.隨著藻藍(lán)蛋白機(jī)制的研究和基因工程技術(shù)的運(yùn)用，藻膽蛋白在醫(yī)藥、保健、食品添加劑、試劑等方面的應(yīng)用前景越來(lái)越廣泛.

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