梅曼彤

(華南農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，廣東 廣州 510642)

2000年，全球人口達到60 億，而到2011年10月，聯(lián)合國宣布此數(shù)字已上升到70 億，預測在未來50年內(nèi)，將會增加到90 億，與此相應的是對食品、醫(yī)藥需求的增長.然而人類當前面對全球耕地面積的減少，能源、資源的短缺，氣候的異常變化，環(huán)境的污染等問題;要在生產(chǎn)更多農(nóng)產(chǎn)品以保證滿足需求增長的同時，保護我們的地球，必須依靠現(xiàn)代科學技術的發(fā)展及其應用.

1 植物生物技術的發(fā)展及應用現(xiàn)狀

隨著分子生物學、遺傳學、細胞生物學、生物化學、信息科學等現(xiàn)代科學和相應技術的迅猛發(fā)展，DNA 體外重組、異源基因導入以及在不同生物體系的表達在20 世紀70年代開始得以實現(xiàn)，并逐步應用于醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)中.在1983年初的國際學術會議上，以及隨后在數(shù)個國際權威學術刊物發(fā)表的文章中，分析報道了美國、歐洲科學家在改造根癌農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒、構建載體、把細菌或植物的基因導入植物細胞并得以表達的成果，宣布了植物生物技術實用化時代的到來.與傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)技術相結合，植物生物技術正在并將在解決人類面臨的困境中發(fā)揮重要作用，不僅成為提供足夠的糧食、飼料的重要手段，而且隨著研究的深入和技術的發(fā)展，植物作為藥物生產(chǎn)的工廠已經(jīng)為期不遠.

國際上，美國植物生物技術的研發(fā)開展較早，且由于一批大公司的介入，產(chǎn)品的開發(fā)較快.在20 世紀80年代中期，以抗生物脅迫為主要目標的第1 代生物技術作物已成功研制，開始進入田間試驗，并在1996年正式進入商品化應用，當年全球種植面積僅170 萬hm2，集中于美國、加拿大等國家.經(jīng)過16年的發(fā)展，到2012年，生物技術作物(基因改造作物，轉基因作物)已在全球28 個國家種植，總面積達1.7億hm2，種植面積最大的是美國及巴西、阿根廷、加拿大等美洲國家(表1).大面積種植的作物為大豆、玉米、棉花、油菜.改造的性狀主要以減少種植者投入為目標，屬第1 代開發(fā)產(chǎn)品，如通過導入編碼莽草酸羥基乙酰轉移酶(EPSPS)或磷絲菌素乙酰轉移酶(PAT)基因，而提高作物對非選擇性除草劑草甘磷、草銨磷的耐受性;導入編碼蘇云金桿菌內(nèi)毒素蛋白基因而抗鱗翅目昆蟲，如棉鈴蟲、玉米螟等.其中，耐除草劑性狀始終是第1 代生物技術作物改變的主要性狀，在2011年，該性狀被應用在大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿中，種植面積為9 390 萬hm2.

在20 世紀90年代，我國分子生物學家和育種學家合作，獲得了具有自主知識產(chǎn)權的轉基因抗蟲棉花植株和相關專利，育成的眾多品種已在全國各個棉區(qū)普遍種植.農(nóng)業(yè)部在上世紀90年代，分別對轉基因抗蟲棉、轉基因抗病番茄、甜椒等授予了安全證書，但后兩者由于無明顯商業(yè)價值，并未應用于生產(chǎn).按照我國農(nóng)業(yè)轉基因生物安全管理條例，經(jīng)過5個階段嚴格的安全評價后，農(nóng)業(yè)部于2009年11月向轉cry1Ab/cry1Ac 基因抗蟲水稻華恢1 號、轉cry1Ab/cry1Ac 基因抗蟲水稻Bt 汕優(yōu)63 在湖北省的生產(chǎn)應用，以及轉植酸酶基因玉米BVLA430101 在山東省生產(chǎn)應用發(fā)放了安全證書，但這些品種仍須通過品種審定方可進入種子銷售市場.

表1 2012年全球各國種植生物技術作物的面積1)Tab.1 Global area of biotech crops in 2012 (by country，Million hectares)

作為植物生物技術發(fā)展較早的國家，美國自上世紀90年代以來，不斷有新產(chǎn)品(品種)的研發(fā)，并經(jīng)由美國農(nóng)業(yè)部動植物檢疫部門、環(huán)保局、食品藥品管理局等生物技術產(chǎn)品監(jiān)管機構根據(jù)產(chǎn)品對人類或動物食用、對環(huán)境安全影響的全面評價而確定能否進入市場.表2 列出了1990—2012年美國已批準種植的轉基因作物及所改造的性狀.表中列出的10 種植物中，馬鈴薯和番茄生物技術產(chǎn)品的研發(fā)主要在20 世紀90年代，但由于應用價值不高，并未得到廣泛應用;苜蓿、水稻等為較近期開發(fā)的產(chǎn)品.改造的性狀已從早期單純集中于耐除草劑(大豆、油菜)、抗蟲(玉米、棉花)發(fā)展到通過基因改造與常規(guī)雜交等手段結合，同時改造多個性狀，包括改良營養(yǎng)性狀(如提高大豆、油菜種子油成分中不飽和脂肪酸含量，以改進油營養(yǎng)成分)，提高對非生物脅迫抗性(如抗旱玉米的培育)等.而復合2 種或3 種性狀的生物技術作物的種植面積有明顯的增長，已有不少商用品種是既耐除草劑又抗蟲的，近年來復合性狀的范圍更有所擴大，如，應用大豆遺傳圖譜定位和轉基因技術結合，美國孟山都生物技術公司(簡稱孟山都)2009年推出了既耐除草劑又可增產(chǎn)7%～11%的大豆新品種RReady2Yield (http:∥www.monsanto.com).

表2 美國批準種植的基因改造農(nóng)作物(1990—2012年)1)Tab.2 The genetically engineered crop plants completed all recommended or required reviews for planting in the United States(1990—2012)

2 植物生物技術的新進展及前景

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計，為保證全球人口增長的需求，在2005—2050年期間，全球食品生產(chǎn)的增加要達到70%.在增加農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的同時，還須面對減少資源耗用、滿足消費者對健康食品需求等問題，這些都對植物育種提出了新的要求.作為當代育種重要手段之一的生物技術育種，近年來也把育種目標更多地轉向高產(chǎn)、抗逆(非生物脅迫)、高品質(zhì)等，即所謂第2 代轉基因育種.能合成類胡蘿卜素的金稻米和抗旱玉米MON 87460 是其中2 個成功的例子.

維生素A 缺乏可引起夜盲、干眼病、角膜軟化，甚至與兒童腹瀉等有關，估計全球有過億兒童處于維生素A 缺乏狀態(tài).2000年，瑞士和德國的科學家領導的團隊在《Science》上發(fā)表了他們通過農(nóng)桿菌介導轉化法，把來自植物黃水仙和細菌的β-胡蘿卜素合成途徑相關酶基因——八氫番茄紅素合成酶基因(PSY)、番茄紅素脫氫酶基因(CRT1)、番茄紅素環(huán)化酶基因(帶轉運肽)，用3 個質(zhì)粒共轉化水稻未成熟胚，潮霉素篩選，獲得了種子胚乳為黃色、干種子中胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)為1.6 μg/g 的轉基因水稻株系［1］，開創(chuàng)了這一通過轉基因賦予稻米新營養(yǎng)成分的新領域，因其黃色的胚乳而被命名為金稻米.然而，由于產(chǎn)生的胡蘿卜素含量太低，缺乏實用上的意義.隨后的數(shù)年，這2 位科學家與先正達公司合作，從導入的基因、啟動子來源、篩選標記以及載體的選擇等方面，作了一系列的改變［2］，如用以糖為篩選基礎的標記代替了抗生素抗性的篩選系統(tǒng)，選用胚乳特異表達啟動子、不同水稻品種用于轉化等;而關鍵的突破來自PSY 來源的改變［3］，先正達公司的科學家經(jīng)大量的比較、分析，發(fā)現(xiàn)導入來自玉米的PSY，可明顯把轉基因水稻干種子胚乳中胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)提高到最高可達36.7 μg/g 的水平，其中維生素A 的前體β-胡蘿卜素占80%以上，獲得了GR1/GR2 等株系.β-胡蘿卜素被人吸收后，可經(jīng)歷酶解過程而轉化為維生素A，按照美國國家科學院醫(yī)學研究所推薦的兒童每天所需維生素A 的攝入量，如以金稻米中胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)的保守估計為24 μg/g 計算，只需食用72 g 大米即可提供兒童每天維生素A 需求的50%.成人的自愿食用試驗結果表明［4］，食用量為65～98 g 即可明顯提高血液中維生素A 的含量，可見大米中的β-胡蘿卜素能有效地轉化為維生素A.

金稻米的開發(fā)是學術機構(公共部門)和生物技術企業(yè)(私人部門)合作完成的，為保證其使用達到減少世界上貧困人口、特別是兒童中的維生素A 缺乏癥的研發(fā)目標，享有發(fā)明權和專利權的科學家和公司已達成協(xié)議，無償授予發(fā)展中國家對相關品種的使用權.2005—2010年，通過一系列育種項目，這一性狀已轉育到世界各地多個地方品種中，近期已在國際水稻研究所和菲律賓水稻研究所完成田間試驗，后者擬在2013年向菲律賓政府監(jiān)管當局申報，爭取2014年開始交給農(nóng)民種植(http://www.goldenrice.org).

全球氣候的異常變化、水資源的短缺使耐旱成為了一個重要的育種目標.孟山都的科學家發(fā)現(xiàn)把來自細菌的冷擊蛋白CSP 轉入植物，能賦予受體對非生物脅迫的抵抗能力，如寒冷(擬南芥)，冷、熱和缺水(水稻)，干旱(玉米)等.初步研究顯示，CSP 為一類RNA 伴侶蛋白，存在于細菌和植物中，可能通過在轉錄和翻譯中起作用而調(diào)節(jié)生物對脅迫的反應［5］.鑒于美國中西部玉米種植區(qū)常有旱情，他們的進一步研究集中于玉米的抗旱性，在對多個基因和轉化事件的表型和表達分析比較后，選定了產(chǎn)量、葉片生長、光合效率均表現(xiàn)良好的CspB-Zm 事件1 株系，并與生產(chǎn)品種配成3 個雜交組合，進行控制給水條件下的田間試驗，與非轉基因對照比較，主要表現(xiàn)在籽粒數(shù)和帶籽粒的穗數(shù)增加，平均可增產(chǎn)0.5 t/hm2(10.5%);隨后在美國中西部干旱地區(qū)田間種植，增產(chǎn)達0.75 t/hm2(15%).該品系內(nèi)轉入的目標基因CspB 來自枯草芽孢桿菌，命名為MON 87460，2010年12月美國食品藥品監(jiān)管局已承認該產(chǎn)品的食用安全評價，2011年12月美國農(nóng)業(yè)部解除對其監(jiān)管，成為全球第1 個可供生產(chǎn)應用的抗旱轉基因作物品種.其與常規(guī)品種雜交獲得的雜交種Drought-GardHybrid 已作為孟山都公司的重要新產(chǎn)品在美國推出，以圖提高干旱地區(qū)的玉米產(chǎn)量穩(wěn)定性，有利于農(nóng)民及環(huán)境.

此外，通過不同途徑的改變，以提高產(chǎn)量、抗逆性、品質(zhì)等為目標的研究也有不少報道，如Kebeish等［6］用細菌的乙醇酸分解途徑作為葉綠體光呼吸的旁路，把相關基因引入到擬南芥，以增加光合作用和生物量，發(fā)現(xiàn)轉基因植株生物量增加、光呼吸作用減少、光合作用有所改進;Mao 等［7］、Baum 等［8］利用近年迅速發(fā)展的RNA 干涉(RNAi)技術，開發(fā)全新的抗蟲作物品種培育途徑.其中，中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所植物分子遺傳國家重點實驗室陳曉亞院士領導的課題組發(fā)現(xiàn)［7］，棉花的一種代謝物——棉酚可抑制棉鈴蟲幼蟲的生長，他們從蟲中腸分離了棉酚誘導表達的基因——細胞色素P450基因(CYP6AE14)，研究了其在幼蟲對棉酚耐受性中的關鍵作用;進一步根據(jù)CYP6AE14 編碼序列構建RNA 干涉載體，轉化植物(擬南芥、煙草)，用這些表達特異雙鏈RNA 的葉子喂飼棉鈴蟲幼蟲，其中腸CYP6AE14 轉錄水平下降，生長緩慢，在飼料中加入棉酚后生長抑制大大增加;試驗結果表明，植物介導CYP6AE14 基因的RNA 干涉可有效增大棉酚對棉鈴蟲的毒性.這一研究結果提出了通過植物表達雙鏈RNA，喂飼昆蟲可成為啟動昆蟲RNA 干涉的新策略，未來可應用于昆蟲研究和田間害蟲的控制中.

第3 代的生物技術育種常指用植物生產(chǎn)各種重組蛋白，包括藥用蛋白、工業(yè)用蛋白，也有報道稱之為“植物分子農(nóng)業(yè)(Plant molecular farming，PMF)”，它包括了從植物種植(或細胞培養(yǎng))、收獲、運輸、儲藏到蛋白質(zhì)抽提、純化的下游過程［9］.早在20 世紀90年代初，當植物轉基因技術日漸成熟時，由于轉基因植物具有成本低、容易規(guī)?；?、可避免人源和動物源病原物污染等優(yōu)點，被認為可以作為生物藥物生產(chǎn)的一個重要系統(tǒng);早期的設想多是擬在植物果實中表達疫苗，通過食用即可賦予使用者對該種傳染病的預防能力.1992年，首個植物生產(chǎn)重組蛋白的報道——美國德克薩斯州的科學家在植物成功表達乙型肝炎表面抗原的文章發(fā)表于美國科學院院刊(PNAS)［10］，隨后，類似研究也申請獲得美國專利.然而，由于蛋白表達量低、穩(wěn)定性差、食用難以控制疫苗劑量等問題，這類疫苗從未達到商業(yè)生產(chǎn)、投放市場的水平.十多年后，美國陶氏農(nóng)業(yè)科學公司于2006年初宣布，其應用煙草細胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)的禽類新城疫病毒疫苗已得到美國農(nóng)業(yè)部批準，為全球第1 個獲批使用的植物生產(chǎn)疫苗.表3 總結了目前處于臨床試驗，或批準使用的植物生產(chǎn)藥物，包括疫苗、抗體、治療用蛋白和保健用蛋白.應用不同的植物生產(chǎn)體系，如瞬時表達系統(tǒng)等生產(chǎn)的、針對乙型肝炎、狂犬病、H5N1 流感的疫苗已進入不同階段的臨床試驗.由于植物病毒介導的瞬時表達系統(tǒng)可迅速、高量在植物中生產(chǎn)重組蛋白，在抗體生產(chǎn)中有較佳的應用前景，第1 個獲歐盟作為醫(yī)學建議并被美國食品藥品管理局(FDA)批準新藥應用觀察的植物生產(chǎn)抗體是美國植物生物技術公司的產(chǎn)品CaroRxTM，該產(chǎn)品用煙草生產(chǎn)，功效為保護牙齒免受細菌的侵害.抗體外的一些治療用蛋白質(zhì)，如Biolex治療公司研制的用于治療乙型和丙型肝炎的α-干擾素(商品名Locferon)已完成臨床Ⅱ期試驗，而Protalix 生物治療公司研制，用轉基因胡蘿卜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)，用于高歇氏病治療的人葡糖腦苷脂酶(prGCD)于2009年進入III 期臨床試驗，取得良好結果.此外，把編碼重組蛋白基因轉化谷類作物，在其種子胚乳表達，作為保健型產(chǎn)品，也已有數(shù)個成功的例子，如美國Ventria 公司用水稻生產(chǎn)的人乳鐵蛋白、人溶菌酶等，已被批準作為精細化學產(chǎn)品投放市場.

用生物技術手段，在植物生產(chǎn)藥物的發(fā)展中，所用的植物體系主要包括轉基因植物細胞懸浮培養(yǎng)為基礎的生物反應器;用農(nóng)桿菌滲透或病毒感染植物組織而導入重組蛋白基因并在其內(nèi)瞬時表達的體系;以及通過常規(guī)遺傳轉化獲得穩(wěn)定的、在特定部位(如籽粒的胚乳)高效表達目標基因的轉基因株系等.這些體系各有其優(yōu)缺點，如細胞培養(yǎng)體系的生產(chǎn)全過程均在室內(nèi)可控條件下進行，生產(chǎn)系統(tǒng)和產(chǎn)品質(zhì)量可達到醫(yī)藥工業(yè)的標準，且易于通過安全監(jiān)管，但其生產(chǎn)成本高、可用細胞類型少、蛋白表達水平有待提高等問題仍有待解決;瞬時表達最大的優(yōu)點是可在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量的急需產(chǎn)品，如疫苗等，但其運輸、儲存難度大;常規(guī)遺傳轉化獲得的轉基因籽粒易于運輸、儲存以及生產(chǎn)規(guī)?；?，但也存在產(chǎn)品開發(fā)耗時長、田間生產(chǎn)受環(huán)境影響大以及對環(huán)境安全監(jiān)管要求高等問題［11］.

表3 處于臨床試驗或批準使用的植物生產(chǎn)藥物1)Tab.3 Plant-derived pharmaceuticals at clinical stages of development or on market

過去20年的歷史已經(jīng)證明了植物為基礎的體系確實可以生產(chǎn)各種類型的人體蛋白，近年來處于領頭地位的新藥物開發(fā)已到達臨床研究的后期階段，即將進入市場.作為一個低成本、高產(chǎn)的生物藥物生產(chǎn)系統(tǒng)，各國政府、各種基金會、企業(yè)公司紛紛投放資金支持相關研究，以取得領先地位.如歐盟的Pharma Planta 聯(lián)盟，日本經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)省Meti 項目，美國的Blue Angel 項目，巴西的PMP 計劃等.

植物生物技術發(fā)展的成果是生物科學研究、技術開發(fā)、商業(yè)性生產(chǎn)三者結合的結果.30年來，它已從實驗室走到了大田，證明了在增加糧食和飼料生產(chǎn)中發(fā)揮的作用.隨著生命科學的發(fā)展，大量新技術的出現(xiàn)，這一新的育種技術及其應用范圍也在不斷的改進中:在基因來源方面，更多的來源于植物自身的基因正在取代第1 代轉基因作物中的細菌來源或人工合成基因;在目標方面，更多轉向產(chǎn)量乃至總生物量的增加，如在高二氧化碳強度的世界中，通過修飾Rubisco 大單位，改變其熱穩(wěn)定活性，增加葉片中淀粉的合成，進而增加植物的生物量［12］;在影響新產(chǎn)品的關鍵技術——外源基因導入方法方面，新一代的技術——TALEN，即轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases)已被證明可以在植物中定點引起高頻率的基因敲除、插入和取代，可成為一個把外源DNA 定點插入受體植物基因組的重要平臺［13］，該技術的實際應用，將能克服多年來各種方法引入的外源基因均為隨機插入而致的不良效應，按設計獲得所需的轉基因產(chǎn)品;在應用的范圍方面，生物技術的應用使植物已不僅為人類提供食品和飼料，還將提供藥品、工業(yè)用品(如生物活性化合物)和能源產(chǎn)品，如增加可能的能源植物的生物量等，有助于減少人類對石化燃料的依賴［14］.隨著植物生物技術自身的發(fā)展和完善、日漸成熟的監(jiān)管體系以及人們對這一新生事物認識的增加，其應用將逐步為公眾所接受，以在新型的可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中發(fā)揮更大的作用.

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