章家偉，王輝，孫慶榮，王向峰，雷玉萍，帥放文#（1.湖南爾康制藥股份有限公司，長(zhǎng)沙410331；2.湖南省藥用輔料工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410331；3.湖南省食品藥品檢驗(yàn)研究院，長(zhǎng)沙 410001）

苯甲酸是羧基直接與苯環(huán)碳原子連接形成的最簡(jiǎn)單的芳香酸，又稱安息香酸，其在醫(yī)藥、食品、化工等方面應(yīng)用十分廣泛，可用于合成制備多種藥物、防腐劑以及生產(chǎn)苯酚等。

苯甲酸收錄于2010年版《中國(guó)藥典》（二部）[1]、《歐洲藥典》（EP）7.0版、《美國(guó)藥典》（USP）34-《國(guó)家處方集》（NF）29版、《英國(guó)藥典》（BP）2010年版以及《日本藥局方》（JP）16版中，但各國(guó)藥典均未對(duì)苯甲酸有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查，也尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道苯甲酸有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。

苯甲酸的工業(yè)生產(chǎn)方法主要為甲苯液相空氣氧化法[2]，此外，還有三氯甲苯水解法以及鄰苯二甲酸酐脫羧法等[3]。以甲苯為原料合成苯甲酸，其雜質(zhì)主要為副產(chǎn)物苯甲醛以及殘留反應(yīng)物甲苯等。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的苯甲醛的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[4-5]、電位滴定法[6]和分光光度法[7]等；甲苯的檢測(cè)方法主要為氣相色譜法[4]。近年來(lái)，已有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)苯甲醛[8]以及甲苯[9]。在前人工作基礎(chǔ)上，筆者參考文獻(xiàn)資料[10-11]，建立了反相（RP）HPLC法同時(shí)測(cè)定苯甲酸有關(guān)物質(zhì)的方法。結(jié)果表明，所建立的方法簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確，能有效控制藥品質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

LC-15C HPLC儀，配有SPD-20AT紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；XS-205型分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ2200B/FL0016-01超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：100419-200301，純度：100%）、苯甲醛對(duì)照品（批號(hào)：111650-200802，純度：100%）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲苯對(duì)照品（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度：99.8%）；藥用級(jí)苯甲酸（湖南爾康制藥股份有限公司，批號(hào)：20110601195、20110701195、20110801195）；工業(yè)級(jí)苯甲酸（市售，批號(hào)：20110601、20110602、20110603）；乙腈為色譜純，醋酸銨、冰醋酸均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondasilTM-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液（pH 4.0）（80∶20），流速：0.5ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：20μl。

取“2.2”項(xiàng)下苯甲酸、苯甲醛、甲苯對(duì)照品溶液及系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣分析，色譜見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備。分別取苯甲酸、苯甲醛、甲苯對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制備成質(zhì)量濃度分別為4.0mg/ml、4.0μg/ml、3.5μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品貯備液的制備。精密稱取苯甲酸原料藥適量，加流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度約為8mg/ml的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的制備。即“2.2.1”項(xiàng)下3種對(duì)照品的混合溶液。

2.3 方法學(xué)考察

圖1 適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.苯甲酸對(duì)照品溶液；B.苯甲醛對(duì)照品溶液；C.甲苯對(duì)照品溶液；D.系統(tǒng)適用性溶液；1.苯甲酸；2.苯甲醛；3.甲苯Fig 1 HPLC chromatograms of applicability testsA.benzoic acid control solution；B.benzaldehyde control solution；C.toluene control solution；D.system suitability solution；1.benzoic acid；2.benzaldehyde；3.toluene

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。分別取制備的苯甲酸（20μg/ml）、苯甲醛（20μg/ml）和甲苯（1.0mg/ml）對(duì)照品溶液適量，紫外掃描，結(jié)果苯甲酸、苯甲醛和甲苯最大吸收波長(zhǎng)分別為225、245、260nm，光譜見(jiàn)圖2。

圖2 紫外吸收光譜圖1.苯甲酸；2.苯甲醛；3.甲苯Fig 2 UV absorption spectrum1.benzoic acid；2.benzaldehyde；3.toluene

為靈敏檢測(cè)苯甲酸有關(guān)物質(zhì)，所選波長(zhǎng)需使3種物質(zhì)均有較強(qiáng)吸收。參考已有文獻(xiàn)[7-9]，取系統(tǒng)適用性溶液適量，分別選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為230、250、254nm進(jìn)行試驗(yàn)，各物質(zhì)峰面積結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下3種物質(zhì)峰面積值結(jié)果Tab 1 Peak areas of 3kinds of substances at different detection wavelength

由表1可知，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm時(shí)，苯甲酸峰面積最大，苯甲醛峰面積較小，甲苯未檢出；檢測(cè)波長(zhǎng)為250、254nm時(shí)，苯甲酸峰面積減小，苯甲醛、甲苯峰面積均增大。為靈敏檢測(cè)苯甲醛和甲苯，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

2.3.2 流動(dòng)相的確定。取系統(tǒng)適用性溶液適量，選擇甲醇與乙酸銨（0.02mol/L，pH 4.0）溶液比例分別為90∶10、80∶20、70∶30進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，苯甲酸、苯甲醛和甲苯保留時(shí)間及分離度見(jiàn)表2。

表2 不同比例流動(dòng)相及不同流速下3種物質(zhì)保留時(shí)間和分離度結(jié)果Tab 2 Retention time and separation rates of 3kinds of substances with different proportion of mobile phase at different flow rates

由表2可知，隨著流動(dòng)相中乙酸銨比例的增加，各物質(zhì)保留時(shí)間隨之增加，苯甲酸和苯甲醛的分離度也隨之增加。當(dāng)改變流動(dòng)相比例從80∶20到70∶30，分離度增加不明顯，但甲苯保留時(shí)間明顯延長(zhǎng)。為獲得良好的分離度，并縮短色譜分析時(shí)間，選擇甲醇-乙酸銨溶液（80∶20）作為流動(dòng)相。

2.3.3 流速的確定。流速的大小對(duì)各物質(zhì)保留時(shí)間以及分離度有較大影響，本文考察了流速分別為0.4、0.5、0.6ml/min時(shí)對(duì)保留時(shí)間及分離度的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，隨著流速的減慢，各物質(zhì)保留時(shí)間隨之延長(zhǎng)，苯甲酸和苯甲醛的分離度也隨之增加。為獲得良好的分離度，并縮短色譜分析時(shí)間，選擇流速為0.5ml/min。

2.3.4 專屬性考察。（1）未破壞溶液的配制：精密量取供試品貯備液5ml，加流動(dòng)相稀釋定容至10ml，備用。

（2）酸（堿）破壞性試驗(yàn)：精密取供試品貯備液5ml，置于試管中，加1mol/L HCl（NaOH）溶液2ml，搖勻，置于85～90℃水浴中加熱4h，放冷至室溫，用1mol/L NaOH（HCl）溶液中和，加流動(dòng)相稀釋定容至10ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為酸（堿）破壞溶液。

（3）氧化破壞試驗(yàn)：精密取供試品貯備液5ml，置于試管中，加30%雙氧水溶液2ml，搖勻，放置2h，加流動(dòng)相稀釋定容至10ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為氧化破壞溶液。

（4）光照破壞試驗(yàn)：精密取供試品貯備液5ml，置于4700lx強(qiáng)光下照射24h，放冷至室溫，加流動(dòng)相稀釋定容至10ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為光照破壞溶液。

（5）高溫破壞試驗(yàn)：精密取供試品貯備液5ml，置于85～90℃水浴中加熱4h，放冷至室溫，加流動(dòng)相稀釋定容至10ml，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為高溫破壞溶液。

取上述6種溶液進(jìn)樣分析，色譜圖結(jié)果表明該色譜條件下方法專屬性較好，詳見(jiàn)圖3。

圖3 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.未破壞溶液；B.酸破壞溶液；C.堿破壞溶液；D.氧化破壞溶液；E.光照破壞溶液；F.高溫破壞溶液；1.苯甲酸；2.過(guò)氧化氫Fig 3 HPLC chromatograms of destructive testA.solution undestroyed；B.solution destroyed by acid；C.solution destroyed by alkali；D.solution destroyed by oxidation；E.solution destroyed by light；F.solution destroyed by high temperature；1.benzoic acid；2.hydrogen peroxide

2.3.5 線性關(guān)系與檢測(cè)限試驗(yàn)。取苯甲醛、甲苯對(duì)照品制備成為質(zhì)量濃度分別為4.0、3.5μg/ml的溶液，再制備成相應(yīng)的50%、80%、100%、120%、180%的系列溶液，進(jìn)樣。以峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，得回歸方程分別為苯甲醛：y＝94295x－20763（r＝0.9995）；甲苯：y＝2462.9x－482.74（r＝0.9989）。結(jié)果表明，苯甲醛、甲苯檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.0～7.2、1.75～6.30μg/ml。信噪比為3時(shí)得苯甲醛及甲苯的檢測(cè)限分別為0.05、0.2μg/ml。

2.3.6 精密度試驗(yàn)。取“2.3.5”項(xiàng)下100%溶液20μl重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖及峰面積積分值。結(jié)果，苯甲醛、甲苯對(duì)應(yīng)峰面積積分值的RSD分別為1.5%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別于制備后0、2、4、6、8h取“2.3.5”項(xiàng)下100%溶液適量20μl，注入色譜儀，記錄色譜圖及峰面積積分值。結(jié)果，苯甲醛、甲苯峰面積的RSD分別為0.97%、1.02%（n＝6），表明溶液在8h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)。精密吸取供試品貯備液9份各5.0ml，分別置于25ml量瓶中，3份1組，分別添加苯甲醛及甲苯對(duì)照品溶液適量，加流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，搖勻。進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見(jiàn)表3。

2.4 苯甲醛、甲苯限度的確定

為進(jìn)一步控制苯甲酸原料藥的質(zhì)量，對(duì)原料藥中有關(guān)物質(zhì)苯甲醛、甲苯進(jìn)行控制，結(jié)合2010年版《中國(guó)藥典》（二部）對(duì)有關(guān)物質(zhì)的限度要求，建立藥用級(jí)苯甲酸中有關(guān)物質(zhì)苯甲醛、甲苯的測(cè)定方法，方法如下：

供試品溶液的制備：精密稱取苯甲酸原料藥適量，加流動(dòng)相稀釋制成質(zhì)量濃度約為4mg/ml的溶液，搖勻，即得。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果（n＝9）Tab 3Results of recovery tests（n＝9）

雜質(zhì)對(duì)照溶液：分別精密稱取苯甲醛、甲苯對(duì)照品適量，置于同一量瓶中，加流動(dòng)相稀釋制成含苯甲醛4.0、甲苯3.5μg/ml的混合溶液，搖勻，即得。

HPLC條件：色譜柱為C18；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；流動(dòng)相為甲醇-0.02mol/L乙酸銨（pH 4.0）＝80∶20，流速為0.5ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

限度規(guī)定：供試品溶液中苯甲醛、甲苯的峰面積不得大于雜質(zhì)對(duì)照溶液的峰面積（即苯甲醛、甲苯的限度分別為0.10%和0.0875%）。

2.5 樣品中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20μl注入色譜儀，記錄保留時(shí)間及峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算即得。對(duì)3批市售工業(yè)級(jí)及3批藥用級(jí)苯甲酸樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 6批樣品中苯甲醛及甲苯含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 4 Content determination results of benzaldehyde and toluene in 6batches of samples（n＝3）

由表4可見(jiàn)，3批工業(yè)級(jí)樣品中苯甲醛的含量均超出規(guī)定的限度，甲苯未檢出；藥用級(jí)樣品中均未檢出苯甲醛、甲苯，符合藥用要求。

3 討論

孫遠(yuǎn)華等[4]采用氣相色譜法同時(shí)測(cè)定甲苯氧化產(chǎn)物中的甲苯及苯甲醛。該法需用NaOH處理樣品以除去苯甲酸，再用氣相色譜法分析甲苯和苯甲醛的含量，操作不便，且NaOH會(huì)影響苯甲醛的測(cè)定。闞顯文等[6]采用現(xiàn)場(chǎng)電位滴定法，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液作為滴定劑同時(shí)測(cè)定苯甲醛和苯甲酸的含量。該法是基于酸堿反應(yīng)的原理進(jìn)行測(cè)定，專屬性差，酸性物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的干擾?？等暗萚7]采用紫外法同時(shí)檢測(cè)苯甲醛、苯甲酸，其混合物在234nm波長(zhǎng)處的吸光度值只與兩者總濃度有關(guān)，250nm波長(zhǎng)處的吸光度值與苯甲醛濃度成正比，兩者相互影響較大。本文建立了苯甲酸原料藥中有關(guān)物質(zhì)苯甲醛、甲苯的檢查方法，并規(guī)定苯甲醛、甲苯的的含量不得過(guò)0.10%和0.0875%，與已有方法相比，該方法簡(jiǎn)便、靈敏、專屬性強(qiáng)，能同時(shí)測(cè)定3種物質(zhì)，且各物質(zhì)之間未見(jiàn)干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。此外，苯甲酸在《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有設(shè)立有關(guān)物質(zhì)苯甲醛、甲苯檢查項(xiàng)，故本法的建立有利于藥品質(zhì)量的有效控制。

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