魏霞，韓梅，韓瑤，祝清芬（1.山東省食品藥品檢驗所，濟南50101；.濟南市中心醫(yī)院急診科，濟南 5001；.青島華仁藥業(yè)股份有限公司，山東青島 66101）

血液濾過置換液為含有氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、乳酸鈉與葡萄糖的滅菌水溶液，臨床用于血液濾過治療時靜脈補液。本品原質量標準即國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBH05522008中采用熱原檢查法檢查其熱原，按家兔體質量每1kg注射10ml進行試驗[1]。因細菌內毒素檢查法具有操作簡便、快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，且不需建設運行成本較高的動物室，故目前越來越多的品種以細菌內毒素檢查法取代熱原檢查法進行致熱物質的檢查。本試驗對血液濾過置換液的細菌內毒素檢查法進行了方法學研究，以確定該品種采用細菌內毒素檢查法替代熱原檢查法的可行性。

細菌內毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，其中凝膠法為仲裁方法。由于本品細菌內毒素限值（L）較低，凝膠法可供選擇的鱟試劑產品很少，故本文對血液濾過置換液同時進行了凝膠法和光度測定法中動態(tài)濁度法的方法學研究。

1 材料

1.1 儀器

ZH-2型自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；TAL-40A型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；BET-48G細菌內毒素測定儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

血液濾過置換液（青島華仁藥業(yè)股份有限公司提供，非聚氯乙烯共擠膜塑料軟袋裝，批號：C1206102、C1206103、C1206104，規(guī)格：每袋2000ml）；鱟試劑1[湛江博康海洋生物有限公司，批號：1202080，標示靈敏度（λ）：0.03EU/ml]；鱟試劑2（批號：1204140，λ：0.03EU/ml）、動態(tài)濁度法鱟試劑（批號：1106161，λ：0.01～10EU/ml）、細菌內毒素檢查用水（BET水，批號：1111070，規(guī)格：每支5ml）均為湛江安度斯生物有限公司產品；細菌內毒素工作標準品（CSE，中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201174，效價：每支160EU）。

2 方法與結果

2.1 L的確定

本品臨床用于血液濾過治療時靜脈補液用，臨床每次用量較大（每次4～5h，18～25L），本品成人（體質量60kg）每1h可能最大用量為6250ml。根據藥品的L的計算公式[2]，L＝K/M，注射劑的K＝5EU/（kg·h），計算限值L＝5×60/6250＝0.048EU/ml。參考《血液凈化標準操作規(guī)程》[3]中血液濾過置換液細菌內毒素含量小于0.03EU/ml的要求，將本品L定為0.03EU/ml。

2.2 凝膠法[3-4]

2.2.1 鱟試劑靈敏度復核。按2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅪE細菌內毒素檢查法項下鱟試劑靈敏度復核的要求[2]，分別對2批鱟試劑進行靈敏度復核。結果鱟試劑1、2的靈敏度測定值（λc）分別為0.04、0.02EU/ml，均在 0.5λ～2.0λ之間，表明2批鱟試劑均可用于試驗。

2.2.2 干擾試驗。目前市售鱟試劑靈敏度一般為0.5～0.03EU/ml，本品L為0.03EU/ml。根據最大有效稀釋倍數（MVD）＝L/λ，本品只能以供試品原液進行試驗。按規(guī)定，采用2個生產廠家的鱟試劑考察了3批樣品對試驗有無干擾作用。

用BET水將CSE復溶，并稀釋制成含內毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ4種濃度的內毒素溶液，即 0.0625、0.03125、0.0156、0.0078EU/ml（C液）；同時制備含上述濃度的內毒素和供試品原液的內毒素溶液（以供試品原液稀釋上述系列濃度內毒素，得B液）。分別采用2個生產廠家的鱟試劑考察供試品原液對試驗的干擾情況，每一濃度平行做4管。同時另取BET水（D液）和供試品原液（A液）各做2支陰性對照管。分別計算Es和Et[2]，判斷供試品原液對試驗有無干擾作用。結果，Es均在0.5λ～2.0λ之間，3批供試品Et均在0.5Es～2.0Es之間，表明供試品原液對試驗無干擾作用，詳見表1。

表1 凝膠法細菌內毒素檢查干擾試驗結果Tab 1 Results of interference test of bacterial endotoxin test for gel-clot method

2.2.3 凝膠法細菌內毒素檢查。取3批供試品，按2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅪE細菌內毒素檢查法[3]，采用鱟試劑2對供試品進行檢查。結果3批供試品內毒素含量均＜0.03EU/ml，符合擬訂的質量標準。

2.3 動態(tài)濁度法[2，4-5]

2.3.1 制備標準曲線。用BET水將CSE進行稀釋，使其最終細菌內毒素濃度分別為1.0、0.25、0.0625、0.0156EU/ml，各取0.1ml，分別加到預先加有0.1ml鱟試劑的反應管內，混合均勻，插入細菌內毒素測定儀內進行檢測，每一濃度重復3管，同時做陰性對照（NC）；檢測波長為405nm。以平均反應時間的對數值（lgT）為縱坐標、內毒素濃度的對數值（lgc）為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表2。

由表2計算得標準曲線方程lgT＝2.68642－0.36022lgc（r＝－0.9848）（絕對值應＞0.980），平行管之間的RSD均小于10%，陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，表明標準曲線符合規(guī)定。

2.3.2 干擾試驗及供試品測定結果。取CSE復溶，根據標準曲線內毒素濃度的設置，0.125EU/ml接近標準曲線中點設其為λm。以供試品原液作為供試品溶液（A液），同時以供試品原液稀釋至含內毒素0.125EU/ml（B液）。分別取上述各液0.1ml，加到預先加有0.1ml鱟試劑的反應管內，混合均勻，插入儀器內進行測定，每個濃度重復2管。測定結束后，按標準曲線方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素λm的供試品溶液的內毒素含量，并計算該試驗條件下的回收率。

表2 細菌內毒素標準曲線及可靠性分析（n＝3）Tab 2 Standard curves of bacterial endotoxin and analysis of reliability（n＝3）

結果表明，3批供試品標準內毒素回收率在50%～200%，內毒素含量均＜0.03EU/ml，實際含量低于標準曲線檢測限0.0156EU/ml，檢查結果見表3。

表3 動態(tài)濁度法干擾試驗及供試品細菌內毒素含量測定結果（n＝2）Tab 3 Results of interference test of kinetic turbidimetric limulus test and content determination of bacterial endotoxin（n＝2）

3 討論

熱原檢查法和細菌內毒素檢查法均是檢測各種注射用藥物含致熱物質的常用檢查方法。由于家兔耐受性等原因，熱原檢查時供試品注射體積每1kg體質量一般不少于0.5ml，不超過10ml[2]。血液濾過置換液臨床用量較大，原標準采用熱原檢查法，注射體積采用每1kg體質量注射10ml，僅相當于臨床可能的每1h最大用量的1/10，可能會給臨床應用帶來一定的安全隱患。改用細菌內毒素檢查法后，限值定為0.03EU/ml，可以對藥品質量從嚴控制，保障臨床用藥安全。

我國目前細菌內毒素檢查所使用的方法多為凝膠限值法，其檢驗結果只能判斷產品的內毒素含量是否超標，而無法給出準確的含量。隨著鱟試驗方法的測定儀器的不斷完善，內毒素測定已向微量定量方向發(fā)展。定量測定應用于常規(guī)藥品檢查、生產過程質控、各種除熱原方法的評價、特殊樣品的檢查（如血液、尿液、腦脊液）等方面，與凝膠法相比具有靈敏、快捷、準確的特點。目前歐美等國家內毒素檢測多數已經采用了定量方法[6]。動態(tài)濁度法是最常用的定量測定方法之一，通過測定反應溶液達到規(guī)定濁度所需時間或測定溶液自身的濁度變化率定量測定樣品中內毒素含量。該法操作簡單、快速、靈敏度高、檢測范圍寬。動態(tài)濁度法的干擾試驗，以樣品中外加內毒素的回收率進行判斷，若回收率在50%～200%，可認為樣品溶液對試驗無干擾[7]。

本文分別采用凝膠法和動態(tài)濁度法對3個批號的供試品進行了干擾試驗，結果表明，供試品原液對試驗無干擾作用，本品可采用細菌內毒素檢查法替代熱原檢查法。由于本品限值較低，凝膠法可供選擇的鱟試劑靈敏度范圍很窄，采用動態(tài)濁度法，可以通過設定標準曲線的范圍，提高樣品檢測的濃度選擇，也體現(xiàn)了動態(tài)濁度法的優(yōu)越性。

進行細菌內毒素檢查時，含內毒素的供試品溶液的配制，一般采用2倍濃度的供試品溶液和細菌內毒素溶液等比混合的方法。但由于本品限值小，需采用供試品原液進行試驗，只能采用供試品原液稀釋內毒素的方法。為保證干擾試驗時B液和C液采用同一支內毒素標準品，可采用供試品原液對高濃度的內毒素水溶液進行稀釋的方法。

最終確定本品細菌內毒素檢查法標準為：“【檢查】細菌內毒素 取本品，依法檢查（2010年版《中國藥典》二部附錄ⅪE），每1ml中含內毒素量應＜0.03EU”。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.YBH05522008血液濾過置換液[S].2008-05-22.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99、附錄213.

[3] 陳香美.血液凈化標準操作規(guī)程[M].2010年版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2010：73.

[4] 中國食品藥品檢定研究院.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：310-321.

[5] 祝清芬，魏霞.動態(tài)濁度法定量測定多西他賽注射液中細菌內毒素的含量[J].中國藥房，2011，22（1）：54.

[6] 郭萌，李冠民，黃清泉.細菌內毒素研究進展[J].中國實驗動物學報，2009，17（5）：397.

[7] 王莉蓓，陳華龍，姜麗君.動態(tài)濁度法定量檢測血栓通注射液中細菌內毒素[J].齊魯藥事，2011，30（1）：27.