魏霞，韓梅，韓瑤，祝清芬（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)所，濟(jì)南50101；.濟(jì)南市中心醫(yī)院急診科，濟(jì)南 5001；.青島華仁藥業(yè)股份有限公司，山東青島 66101）

血液濾過(guò)置換液為含有氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、乳酸鈉與葡萄糖的滅菌水溶液，臨床用于血液濾過(guò)治療時(shí)靜脈補(bǔ)液。本品原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)即國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH05522008中采用熱原檢查法檢查其熱原，按家兔體質(zhì)量每1kg注射10ml進(jìn)行試驗(yàn)[1]。因細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，且不需建設(shè)運(yùn)行成本較高的動(dòng)物室，故目前越來(lái)越多的品種以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代熱原檢查法進(jìn)行致熱物質(zhì)的檢查。本試驗(yàn)對(duì)血液濾過(guò)置換液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了方法學(xué)研究，以確定該品種采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代熱原檢查法的可行性。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測(cè)定法，其中凝膠法為仲裁方法。由于本品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）較低，凝膠法可供選擇的鱟試劑產(chǎn)品很少，故本文對(duì)血液濾過(guò)置換液同時(shí)進(jìn)行了凝膠法和光度測(cè)定法中動(dòng)態(tài)濁度法的方法學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器

ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；TAL-40A型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

血液濾過(guò)置換液（青島華仁藥業(yè)股份有限公司提供，非聚氯乙烯共擠膜塑料軟袋裝，批號(hào)：C1206102、C1206103、C1206104，規(guī)格：每袋2000ml）；鱟試劑1[湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：1202080，標(biāo)示靈敏度（λ）：0.03EU/ml]；鱟試劑2（批號(hào)：1204140，λ：0.03EU/ml）、動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（批號(hào)：1106161，λ：0.01～10EU/ml）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號(hào)：1111070，規(guī)格：每支5ml）均為湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-201174，效價(jià)：每支160EU）。

2 方法與結(jié)果

2.1 L的確定

本品臨床用于血液濾過(guò)治療時(shí)靜脈補(bǔ)液用，臨床每次用量較大（每次4～5h，18～25L），本品成人（體質(zhì)量60kg）每1h可能最大用量為6250ml。根據(jù)藥品的L的計(jì)算公式[2]，L＝K/M，注射劑的K＝5EU/（kg·h），計(jì)算限值L＝5×60/6250＝0.048EU/ml。參考《血液凈化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[3]中血液濾過(guò)置換液細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于0.03EU/ml的要求，將本品L定為0.03EU/ml。

2.2 凝膠法[3-4]

2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核。按2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法項(xiàng)下鱟試劑靈敏度復(fù)核的要求[2]，分別對(duì)2批鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核。結(jié)果鱟試劑1、2的靈敏度測(cè)定值（λc）分別為0.04、0.02EU/ml，均在 0.5λ～2.0λ之間，表明2批鱟試劑均可用于試驗(yàn)。

2.2.2 干擾試驗(yàn)。目前市售鱟試劑靈敏度一般為0.5～0.03EU/ml，本品L為0.03EU/ml。根據(jù)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）＝L/λ，本品只能以供試品原液進(jìn)行試驗(yàn)。按規(guī)定，采用2個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑考察了3批樣品對(duì)試驗(yàn)有無(wú)干擾作用。

用BET水將CSE復(fù)溶，并稀釋制成含內(nèi)毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ4種濃度的內(nèi)毒素溶液，即 0.0625、0.03125、0.0156、0.0078EU/ml（C液）；同時(shí)制備含上述濃度的內(nèi)毒素和供試品原液的內(nèi)毒素溶液（以供試品原液稀釋上述系列濃度內(nèi)毒素，得B液）。分別采用2個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑考察供試品原液對(duì)試驗(yàn)的干擾情況，每一濃度平行做4管。同時(shí)另取BET水（D液）和供試品原液（A液）各做2支陰性對(duì)照管。分別計(jì)算Es和Et[2]，判斷供試品原液對(duì)試驗(yàn)有無(wú)干擾作用。結(jié)果，Es均在0.5λ～2.0λ之間，3批供試品Et均在0.5Es～2.0Es之間，表明供試品原液對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾作用，詳見(jiàn)表1。

表1 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of interference test of bacterial endotoxin test for gel-clot method

2.2.3 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。取3批供試品，按2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[3]，采用鱟試劑2對(duì)供試品進(jìn)行檢查。結(jié)果3批供試品內(nèi)毒素含量均＜0.03EU/ml，符合擬訂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 動(dòng)態(tài)濁度法[2，4-5]

2.3.1 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。用BET水將CSE進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊渥罱K細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為1.0、0.25、0.0625、0.0156EU/ml，各取0.1ml，分別加到預(yù)先加有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，每一濃度重復(fù)3管，同時(shí)做陰性對(duì)照（NC）；檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm。以平均反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)值（lgT）為縱坐標(biāo)、內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值（lgc）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程lgT＝2.68642－0.36022lgc（r＝－0.9848）（絕對(duì)值應(yīng)＞0.980），平行管之間的RSD均小于10%，陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。

2.3.2 干擾試驗(yàn)及供試品測(cè)定結(jié)果。取CSE復(fù)溶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素濃度的設(shè)置，0.125EU/ml接近標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)設(shè)其為λm。以供試品原液作為供試品溶液（A液），同時(shí)以供試品原液稀釋至含內(nèi)毒素0.125EU/ml（B液）。分別取上述各液0.1ml，加到預(yù)先加有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入儀器內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)2管。測(cè)定結(jié)束后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素λm的供試品溶液的內(nèi)毒素含量，并計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率。

表2 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及可靠性分析（n＝3）Tab 2 Standard curves of bacterial endotoxin and analysis of reliability（n＝3）

結(jié)果表明，3批供試品標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素回收率在50%～200%，內(nèi)毒素含量均＜0.03EU/ml，實(shí)際含量低于標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)限0.0156EU/ml，檢查結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 動(dòng)態(tài)濁度法干擾試驗(yàn)及供試品細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab 3 Results of interference test of kinetic turbidimetric limulus test and content determination of bacterial endotoxin（n＝2）

3 討論

熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法均是檢測(cè)各種注射用藥物含致熱物質(zhì)的常用檢查方法。由于家兔耐受性等原因，熱原檢查時(shí)供試品注射體積每1kg體質(zhì)量一般不少于0.5ml，不超過(guò)10ml[2]。血液濾過(guò)置換液臨床用量較大，原標(biāo)準(zhǔn)采用熱原檢查法，注射體積采用每1kg體質(zhì)量注射10ml，僅相當(dāng)于臨床可能的每1h最大用量的1/10，可能會(huì)給臨床應(yīng)用帶來(lái)一定的安全隱患。改用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法后，限值定為0.03EU/ml，可以對(duì)藥品質(zhì)量從嚴(yán)控制，保障臨床用藥安全。

我國(guó)目前細(xì)菌內(nèi)毒素檢查所使用的方法多為凝膠限值法，其檢驗(yàn)結(jié)果只能判斷產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量是否超標(biāo)，而無(wú)法給出準(zhǔn)確的含量。隨著鱟試驗(yàn)方法的測(cè)定儀器的不斷完善，內(nèi)毒素測(cè)定已向微量定量方向發(fā)展。定量測(cè)定應(yīng)用于常規(guī)藥品檢查、生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控、各種除熱原方法的評(píng)價(jià)、特殊樣品的檢查（如血液、尿液、腦脊液）等方面，與凝膠法相比具有靈敏、快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。目前歐美等國(guó)家內(nèi)毒素檢測(cè)多數(shù)已經(jīng)采用了定量方法[6]。動(dòng)態(tài)濁度法是最常用的定量測(cè)定方法之一，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)溶液達(dá)到規(guī)定濁度所需時(shí)間或測(cè)定溶液自身的濁度變化率定量測(cè)定樣品中內(nèi)毒素含量。該法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬。動(dòng)態(tài)濁度法的干擾試驗(yàn)，以樣品中外加內(nèi)毒素的回收率進(jìn)行判斷，若回收率在50%～200%，可認(rèn)為樣品溶液對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾[7]。

本文分別采用凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)3個(gè)批號(hào)的供試品進(jìn)行了干擾試驗(yàn)，結(jié)果表明，供試品原液對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾作用，本品可采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代熱原檢查法。由于本品限值較低，凝膠法可供選擇的鱟試劑靈敏度范圍很窄，采用動(dòng)態(tài)濁度法，可以通過(guò)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，提高樣品檢測(cè)的濃度選擇，也體現(xiàn)了動(dòng)態(tài)濁度法的優(yōu)越性。

進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，含內(nèi)毒素的供試品溶液的配制，一般采用2倍濃度的供試品溶液和細(xì)菌內(nèi)毒素溶液等比混合的方法。但由于本品限值小，需采用供試品原液進(jìn)行試驗(yàn)，只能采用供試品原液稀釋內(nèi)毒素的方法。為保證干擾試驗(yàn)時(shí)B液和C液采用同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，可采用供試品原液對(duì)高濃度的內(nèi)毒素水溶液進(jìn)行稀釋的方法。

最終確定本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法標(biāo)準(zhǔn)為：“【檢查】細(xì)菌內(nèi)毒素 取本品，依法檢查（2010年版《中國(guó)藥典》二部附錄ⅪE），每1ml中含內(nèi)毒素量應(yīng)＜0.03EU”。

[1] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.YBH05522008血液濾過(guò)置換液[S].2008-05-22.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99、附錄213.

[3] 陳香美.血液凈化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[M].2010年版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2010：73.

[4] 中國(guó)食品藥品檢定研究院.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：310-321.

[5] 祝清芬，魏霞.動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定多西他賽注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量[J].中國(guó)藥房，2011，22（1）：54.

[6] 郭萌，李冠民，黃清泉.細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，17（5）：397.

[7] 王莉蓓，陳華龍，姜麗君.動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)血栓通注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素[J].齊魯藥事，2011，30（1）：27.