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        血液濾過置換液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究

        2013-08-29 13:18:58魏霞韓梅韓瑤祝清芬山東省食品藥品檢驗(yàn)所濟(jì)南50101濟(jì)南市中心醫(yī)院急診科濟(jì)南5001青島華仁藥業(yè)股份有限公司山東青島66101
        中國(guó)藥房 2013年29期
        關(guān)鍵詞:檢查法原液本品

        魏霞,韓梅,韓瑤,祝清芬(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)所,濟(jì)南50101;.濟(jì)南市中心醫(yī)院急診科,濟(jì)南 5001;.青島華仁藥業(yè)股份有限公司,山東青島 66101)

        血液濾過置換液為含有氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、乳酸鈉與葡萄糖的滅菌水溶液,臨床用于血液濾過治療時(shí)靜脈補(bǔ)液。本品原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)即國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH05522008中采用熱原檢查法檢查其熱原,按家兔體質(zhì)量每1kg注射10ml進(jìn)行試驗(yàn)[1]。因細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),且不需建設(shè)運(yùn)行成本較高的動(dòng)物室,故目前越來越多的品種以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代熱原檢查法進(jìn)行致熱物質(zhì)的檢查。本試驗(yàn)對(duì)血液濾過置換液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了方法學(xué)研究,以確定該品種采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代熱原檢查法的可行性。

        細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測(cè)定法,其中凝膠法為仲裁方法。由于本品細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)較低,凝膠法可供選擇的鱟試劑產(chǎn)品很少,故本文對(duì)血液濾過置換液同時(shí)進(jìn)行了凝膠法和光度測(cè)定法中動(dòng)態(tài)濁度法的方法學(xué)研究。

        1 材料

        1.1 儀器

        ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠);TAL-40A型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司);BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)。

        1.2 藥品與試劑

        血液濾過置換液(青島華仁藥業(yè)股份有限公司提供,非聚氯乙烯共擠膜塑料軟袋裝,批號(hào):C1206102、C1206103、C1206104,規(guī)格:每袋2000ml);鱟試劑1[湛江博康海洋生物有限公司,批號(hào):1202080,標(biāo)示靈敏度(λ):0.03EU/ml];鱟試劑2(批號(hào):1204140,λ:0.03EU/ml)、動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑(批號(hào):1106161,λ:0.01~10EU/ml)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水,批號(hào):1111070,規(guī)格:每支5ml)均為湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE,中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):150601-201174,效價(jià):每支160EU)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 L的確定

        本品臨床用于血液濾過治療時(shí)靜脈補(bǔ)液用,臨床每次用量較大(每次4~5h,18~25L),本品成人(體質(zhì)量60kg)每1h可能最大用量為6250ml。根據(jù)藥品的L的計(jì)算公式[2],L=K/M,注射劑的K=5EU/(kg·h),計(jì)算限值L=5×60/6250=0.048EU/ml。參考《血液凈化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[3]中血液濾過置換液細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于0.03EU/ml的要求,將本品L定為0.03EU/ml。

        2.2 凝膠法[3-4]

        2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核。按2010年版《中國(guó)藥典》(二部)附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法項(xiàng)下鱟試劑靈敏度復(fù)核的要求[2],分別對(duì)2批鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核。結(jié)果鱟試劑1、2的靈敏度測(cè)定值(λc)分別為0.04、0.02EU/ml,均在 0.5λ~2.0λ之間,表明2批鱟試劑均可用于試驗(yàn)。

        2.2.2 干擾試驗(yàn)。目前市售鱟試劑靈敏度一般為0.5~0.03EU/ml,本品L為0.03EU/ml。根據(jù)最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)=L/λ,本品只能以供試品原液進(jìn)行試驗(yàn)。按規(guī)定,采用2個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑考察了3批樣品對(duì)試驗(yàn)有無(wú)干擾作用。

        用BET水將CSE復(fù)溶,并稀釋制成含內(nèi)毒素2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ4種濃度的內(nèi)毒素溶液,即 0.0625、0.03125、0.0156、0.0078EU/ml(C液);同時(shí)制備含上述濃度的內(nèi)毒素和供試品原液的內(nèi)毒素溶液(以供試品原液稀釋上述系列濃度內(nèi)毒素,得B液)。分別采用2個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑考察供試品原液對(duì)試驗(yàn)的干擾情況,每一濃度平行做4管。同時(shí)另取BET水(D液)和供試品原液(A液)各做2支陰性對(duì)照管。分別計(jì)算Es和Et[2],判斷供試品原液對(duì)試驗(yàn)有無(wú)干擾作用。結(jié)果,Es均在0.5λ~2.0λ之間,3批供試品Et均在0.5Es~2.0Es之間,表明供試品原液對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾作用,詳見表1。

        表1 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of interference test of bacterial endotoxin test for gel-clot method

        2.2.3 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。取3批供試品,按2010年版《中國(guó)藥典》(二部)附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[3],采用鱟試劑2對(duì)供試品進(jìn)行檢查。結(jié)果3批供試品內(nèi)毒素含量均<0.03EU/ml,符合擬訂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

        2.3 動(dòng)態(tài)濁度法[2,4-5]

        2.3.1 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。用BET水將CSE進(jìn)行稀釋,使其最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為1.0、0.25、0.0625、0.0156EU/ml,各取0.1ml,分別加到預(yù)先加有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi),混合均勻,插入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),每一濃度重復(fù)3管,同時(shí)做陰性對(duì)照(NC);檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm。以平均反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)值(lgT)為縱坐標(biāo)、內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值(lgc)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表2。

        由表2計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程lgT=2.68642-0.36022lgc(r=-0.9848)(絕對(duì)值應(yīng)>0.980),平行管之間的RSD均小于10%,陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間,表明標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。

        2.3.2 干擾試驗(yàn)及供試品測(cè)定結(jié)果。取CSE復(fù)溶,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)毒素濃度的設(shè)置,0.125EU/ml接近標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)設(shè)其為λm。以供試品原液作為供試品溶液(A液),同時(shí)以供試品原液稀釋至含內(nèi)毒素0.125EU/ml(B液)。分別取上述各液0.1ml,加到預(yù)先加有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi),混合均勻,插入儀器內(nèi)進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度重復(fù)2管。測(cè)定結(jié)束后,按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素λm的供試品溶液的內(nèi)毒素含量,并計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率。

        表2 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及可靠性分析(n=3)Tab 2 Standard curves of bacterial endotoxin and analysis of reliability(n=3)

        結(jié)果表明,3批供試品標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素回收率在50%~200%,內(nèi)毒素含量均<0.03EU/ml,實(shí)際含量低于標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)限0.0156EU/ml,檢查結(jié)果見表3。

        表3 動(dòng)態(tài)濁度法干擾試驗(yàn)及供試品細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定結(jié)果(n=2)Tab 3 Results of interference test of kinetic turbidimetric limulus test and content determination of bacterial endotoxin(n=2)

        3 討論

        熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法均是檢測(cè)各種注射用藥物含致熱物質(zhì)的常用檢查方法。由于家兔耐受性等原因,熱原檢查時(shí)供試品注射體積每1kg體質(zhì)量一般不少于0.5ml,不超過10ml[2]。血液濾過置換液臨床用量較大,原標(biāo)準(zhǔn)采用熱原檢查法,注射體積采用每1kg體質(zhì)量注射10ml,僅相當(dāng)于臨床可能的每1h最大用量的1/10,可能會(huì)給臨床應(yīng)用帶來一定的安全隱患。改用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法后,限值定為0.03EU/ml,可以對(duì)藥品質(zhì)量從嚴(yán)控制,保障臨床用藥安全。

        我國(guó)目前細(xì)菌內(nèi)毒素檢查所使用的方法多為凝膠限值法,其檢驗(yàn)結(jié)果只能判斷產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量是否超標(biāo),而無(wú)法給出準(zhǔn)確的含量。隨著鱟試驗(yàn)方法的測(cè)定儀器的不斷完善,內(nèi)毒素測(cè)定已向微量定量方向發(fā)展。定量測(cè)定應(yīng)用于常規(guī)藥品檢查、生產(chǎn)過程質(zhì)控、各種除熱原方法的評(píng)價(jià)、特殊樣品的檢查(如血液、尿液、腦脊液)等方面,與凝膠法相比具有靈敏、快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。目前歐美等國(guó)家內(nèi)毒素檢測(cè)多數(shù)已經(jīng)采用了定量方法[6]。動(dòng)態(tài)濁度法是最常用的定量測(cè)定方法之一,通過測(cè)定反應(yīng)溶液達(dá)到規(guī)定濁度所需時(shí)間或測(cè)定溶液自身的濁度變化率定量測(cè)定樣品中內(nèi)毒素含量。該法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬。動(dòng)態(tài)濁度法的干擾試驗(yàn),以樣品中外加內(nèi)毒素的回收率進(jìn)行判斷,若回收率在50%~200%,可認(rèn)為樣品溶液對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾[7]。

        本文分別采用凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)3個(gè)批號(hào)的供試品進(jìn)行了干擾試驗(yàn),結(jié)果表明,供試品原液對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾作用,本品可采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代熱原檢查法。由于本品限值較低,凝膠法可供選擇的鱟試劑靈敏度范圍很窄,采用動(dòng)態(tài)濁度法,可以通過設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍,提高樣品檢測(cè)的濃度選擇,也體現(xiàn)了動(dòng)態(tài)濁度法的優(yōu)越性。

        進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí),含內(nèi)毒素的供試品溶液的配制,一般采用2倍濃度的供試品溶液和細(xì)菌內(nèi)毒素溶液等比混合的方法。但由于本品限值小,需采用供試品原液進(jìn)行試驗(yàn),只能采用供試品原液稀釋內(nèi)毒素的方法。為保證干擾試驗(yàn)時(shí)B液和C液采用同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品,可采用供試品原液對(duì)高濃度的內(nèi)毒素水溶液進(jìn)行稀釋的方法。

        最終確定本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法標(biāo)準(zhǔn)為:“【檢查】細(xì)菌內(nèi)毒素 取本品,依法檢查(2010年版《中國(guó)藥典》二部附錄ⅪE),每1ml中含內(nèi)毒素量應(yīng)<0.03EU”。

        [1] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.YBH05522008血液濾過置換液[S].2008-05-22.

        [2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:二部[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄99、附錄213.

        [3] 陳香美.血液凈化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[M].2010年版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2010:73.

        [4] 中國(guó)食品藥品檢定研究院.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:310-321.

        [5] 祝清芬,魏霞.動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定多西他賽注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量[J].中國(guó)藥房,2011,22(1):54.

        [6] 郭萌,李冠民,黃清泉.細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2009,17(5):397.

        [7] 王莉蓓,陳華龍,姜麗君.動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)血栓通注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素[J].齊魯藥事,2011,30(1):27.

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