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        可剪切聚乙二醇及TAT肽共修飾多柔比星脂質(zhì)體的制備及表征Δ

        2013-08-29 13:18:54朱亞勤李玲胡青黃發(fā)珍程亮程麗芳陳大為蘇州大學(xué)藥學(xué)院江蘇蘇州2523沈陽藥科大學(xué)沈陽006
        中國藥房 2013年29期
        關(guān)鍵詞:脂質(zhì)體純度乙腈

        朱亞勤,李玲,胡青,黃發(fā)珍,程亮,程麗芳,陳大為,2#(.蘇州大學(xué)藥學(xué)院,江蘇蘇州2523;2.沈陽藥科大學(xué),沈陽 006)

        多柔比星(DOX)是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物,但是它的毒副作用如骨髓抑制、心臟毒性等限制了其臨床應(yīng)用[1]。脂質(zhì)體作為一種新型給藥系統(tǒng),具有不良反應(yīng)小、無免疫原性和可生物降解等優(yōu)點。將DOX包裹入脂質(zhì)體可顯著降低藥物毒性,改善藥物抗腫瘤效果[2]。

        TAT肽是一種細(xì)胞穿膜肽[3],其有效序列為AYGRKKRRQRRR,在生理pH下帶正電荷。研究表明,TAT肽可顯著提高脂質(zhì)體、膠束等的細(xì)胞攝取[4],增強化療藥物的抗腫瘤效果。然而,TAT肽無細(xì)胞選擇性,直接與納米載體相連后會降低納米載體在體內(nèi)的腫瘤靶向性。本研究將可剪切的聚乙二醇(PEG)5000連接在脂質(zhì)體表面,TAT肽通過PEG2000連接隱藏在內(nèi)層,構(gòu)建可剪切PEG及TAT肽共修飾DOX脂質(zhì)體(C-TAT-DOX-LP),并對其進行表征。

        1 材料

        RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司);Nicomp TM380ZLS粒徑分析儀(美國Nicomp公司);DeBEE高壓微射流納米均質(zhì)機(美國Nano DeBEE公司);SPD-M20A高效液相色譜儀(日本島津公司)。

        鹽酸DOX(原料藥,北京華奉聯(lián)博科技技術(shù)有限公司,批號:HF100622,純度:>99.5%);二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(DSPE,上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司,批號:100929,純度:≥99%);大豆卵磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司,批號:040403,純度:96%);膽固醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號:F20101215,純度:95%);TAT-半胱氨酸(TAT-Cys,上海吉爾生化有限公司,批號:P120322-CQ289039,純度:98%);N-羥基丁二酰亞胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺(NHS-PEG2000-Mal,北京鍵凱科技有限公司,批號:ZZ112P038,純度:95%);N-琥珀酰-3-2-聯(lián)巰基吡啶-丙酸鹽(SPDP,圣克魯斯生物技術(shù)上海有限公司,批號:A1912,純度:95%);甲氧基-聚乙二醇 5000-巰基(CH3O-PEG5000-SH,上海炎怡生物有限公司,批號:B120628,純度:≥95%);二硫蘇糖醇(DTT,上海前塵生物科技有限公司,批號:233155,純度:≥99.5%);透析袋(分子質(zhì)量:8000~14000,上海源葉生物科技有限公司);氯仿為分析純,乙腈、三氟乙酸為色譜純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-二硫鍵-聚乙二醇5000(DSPE-S-S-PEG5000)的合成與表征

        2.1.1 DSPE-S-S-PEG5000的合成。根據(jù)參考文獻[5],DSPES-S-PEG5000的合成步驟如下:稱取20mg DSPE、8.2mg SPDP溶于無水氯仿中,加入適量三乙胺,N2保護,室溫黑暗下攪拌反應(yīng)5h。薄層色譜(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進程。將80mg Ch3OPEG5000-SH溶解于氯仿反應(yīng)液,繼續(xù)反應(yīng)12h,反應(yīng)結(jié)束后,冷乙腈中沉淀除去未反應(yīng)的DSPE。3000r/min離心5min,上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈,加純水置透析袋中透析48h,凍干。

        2.1.2 DSPE-S-S-PEG5000的核磁氫譜(1H-NMR)表征。1HNMR(溶劑:氘代氯仿)表征,DSPE:δ 0.88(t,—CH3,6H),1.25(s,—CH2—,56H),PEG:3.65(s,—CH2—,456H),見圖1。

        圖1 DSPE-S-S-PEG5000的1H-NMR圖Fig 1 1H-NMR spectrum of DSPE-S-S-PEG5000

        以上特征峰表明PEG5000成功連接到了DSPE上。以δ3.65與δ1.25處峰面積比計算產(chǎn)物純度,結(jié)果產(chǎn)物純度約為84.4%。

        2.2 DSPE-PEG2000-TAT的合成與表征

        2.2.1 DSPE-PEG2000-TAT的合成。根據(jù)參考文獻[6],DSPEPEG2000-TAT的合成方法如下:按物質(zhì)的量之比1.2∶1稱取DSPE、NHS-PEG2000-Mal溶于無水氯仿中,滴加5μl三乙胺,N2保護,室溫反應(yīng)5h。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿,冷乙腈沉淀DSPE,上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除乙腈。產(chǎn)物透析48h,冷凍干燥。按物質(zhì)的量之比1∶1.2稱取DSPEPEG2000-Mal、TAT-Cys,溶于純水,N2保護下,輕微攪拌。TLC監(jiān)測反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后置透析袋中透析48h,冷凍干燥。

        2.2.2 DSPE-PEG2000-TAT的紅外光譜(IR)表征。分別取適量TAT-Cys、DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG2000-TAT,加KBr壓片,IR表征見圖2。

        圖2 紅外光譜圖a.TAT-Cys;b.DSPE-PEG2000-Mal;c.DSPE-PEG2000-TATFig 2 FTIR spectrumsa.TAT-Cys;b.DSPE-PEG2000-Mal;c.DSPE-PEG2000-TAT

        其中,a圖中2556cm-1為TAT-Cys中巰基(—SH)的特征吸收峰,在c圖中該吸收峰消失,b圖中在此位置無吸收峰干擾,證明TAT肽中—SH與DSPE-PEG2000-Mal中的Mal基團已成功連接。b、c圖中2920cm-1、2850cm-1為PEG中C—H伸縮振動,1104cm-1為PEG中C—O伸縮振動,a、c圖中1664cm-1為TAT肽中酰胺鍵C—O伸縮振動,表明已成功合成DSPE-PEG2000-TAT。

        2.3 TAT肽連接率的測定

        2.3.1 TAT肽含量測定色譜條件。色譜柱:Promosil C18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:A(乙腈+0.1%三氟乙酸)-B(水+0.1%三氟乙酸),梯度洗脫:0~12min,A:12%~37%,B:63%~88%,12~16min,A:37%~100%,B:0~63%;流速:1.0ml/min;檢測波長:220nm;柱溫:30℃;進樣量:20μl。

        2.3.2 方法學(xué)考察。依法進行精密度和回收率試驗。結(jié)果低、中、高水平的日內(nèi)精密度RSD分別為0.30%、0.67%、0.58%(n=5),日間精密度RSD分別為1.56%、1.23%、1.31%(n=5);回收率分別為(98.68±0.23)% 、(99.49±0.21)%、(99.40±0.43)%,RSD分別為0.62%、0.71%、0.75%(n=5)。

        2.3.3 測定方法。反應(yīng)前精密稱取TAT-Cys,配制成100μg/ml的溶液,按“2.3.1”項色譜條件進樣20μl,記錄峰面積為A1;反應(yīng)后取適量反應(yīng)液稀釋后按相同色譜條件進樣,記錄峰面積為A2,色譜見圖3。

        由圖3可見,DSPE-PEG2000-Mal在此條件下對TAT肽無干擾。根據(jù)外標(biāo)一點法計算未反應(yīng)的TAT肽的量[=(100×A2×稀釋倍數(shù)×反應(yīng)液體積)/A1],進一步計算得到TAT肽的連接率[=(反應(yīng)前TAT肽的量-反應(yīng)后TAT肽的量)/TAT肽理論反應(yīng)量×100%],經(jīng)計算為96.3%。

        2.4 脂質(zhì)體的制備

        圖3 TAT肽的HPLC色譜圖a.反應(yīng)前TAT肽;b.反應(yīng)后TAT肽;c.DSPE-PEG2000-MalFig 3 HPLC chromatograms of TAT peptidea.TAT peptide before reaction;b.TAT peptide after reaction;c.DSPEPEG2000-Mal

        采用薄膜分散法及pH梯度法制備DOX脂質(zhì)體(DOXLP),以后插入法[7]制備TAT肽修飾的DOX-LP(TAT-DOX-LP)、C-TAT-DOX-LP。方法如下:稱取適量大豆卵磷脂、膽固醇溶于無水乙醇,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜。加入pH 4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液,40℃水化20min。所得的脂質(zhì)體進行超聲粉碎(100W,400s),經(jīng)高壓微射流處理(20000psi,5min)后得空白脂質(zhì)體(Blank-LP)溶液。取Blank-LP溶液適量,用0.1mol/L的Na2HPO4溶液調(diào)pH至7.6。按藥脂比1∶15稱取DOX溶于pH 7.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中,將其緩慢滴加到Blank-LP溶液中,70℃溫浴30min后,立即冷卻,即得DOX-LP,未包封的DOX以透析法除去。取DSPE-S-S-PEG5000、DSPE-PEG2000-TAT各適量溶于pH 7.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中形成膠束溶液,按物質(zhì)的量之比分別吸取適量膠束溶液滴入DOX-LP中,55℃條件下溫浴1h,冷卻后即得到C-TAT-DOX-LP,以同樣方法制備TAT-DOX-LP。

        2.5 粒徑及Zeta電位的測定

        取Blank-LP、DOX-LP、TAT-DOX-LP及C-TAT-DOX-LP各適量,蒸餾水稀釋后用粒徑分析儀測定粒徑及電位。結(jié)果,所得脂質(zhì)體粒徑均在200nm以下,除TAT-DOX-LP帶正電外,其他類型脂質(zhì)體均帶負(fù)電,見表1。

        表1 不同脂質(zhì)體粒徑、電位、包封率測定結(jié)果(±s,n=3)Tab 1 Particle size,Zeta-potential and encapsulation efficiency of different liposomes(±s,n=3)

        表1 不同脂質(zhì)體粒徑、電位、包封率測定結(jié)果(±s,n=3)Tab 1 Particle size,Zeta-potential and encapsulation efficiency of different liposomes(±s,n=3)

        包封率,%093.5±0.892.1±1.391.8±1.5脂質(zhì)體類型Blank-LP DOX-LP TAT-DOX-LP C-TAT-DOX-LP粒徑,nm 108.2±2.4116.4±1.4122.1±2.3152.1±1.2Zeta電位,mV-8.6±0.5-14.4±0.78.4±0.4-5.4±0.3

        2.6 透射電鏡(TEM)形態(tài)觀察

        取DOX-LP及C-TAT-DOX-LP適量,滴加至專用銅網(wǎng)上,樣品干燥后進行TEM掃描,結(jié)果見圖4。

        由此可見二者在形態(tài)上無明顯差別,分布均勻且呈球形。

        2.7 包封率的測定

        2.7.1 色譜條件。色譜柱:Promosil C18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:水(含0.01mol/L磷酸二氫胺)-甲醇(35∶65);流速:1.0ml/min;柱溫:30℃;檢測波長:497nm;進樣量:20μl。

        2.7.2 方法學(xué)考察。依法進行精密度和回收率試驗。結(jié)果低、中、高水平的日內(nèi)精密度RSD分別為0.43%、0.41%、0.32%(n=5),日間精密度RSD為0.62%、0.78%、0.58%(n=5);回收率分別為(98.75±0.52)%、(98.82±0.31)%、(100.04±0.52)%,RSD分別為0.52%、0.81%、0.63%(n=5)。

        圖42 種脂質(zhì)體的TEM圖A.DOX-LP;B.C-TAT-DOX-LPFig 4 TEM micrograph of 2kinds of liposomesA.DOX-LP;B.C-TAT-DOX-LP

        線性關(guān)系考察。標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:精密稱取鹽酸DOX適量,配成1.0mg/ml的母液,然后分別配成1、5、10、20、40μg/ml的溶液。按“2.7.1”項下色譜條件進樣,以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(c)進行回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=12129.4c-1064.5(r=0.9998)。結(jié)果表明,DOX的檢測質(zhì)量濃度在1~40μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

        2.7.3 包封率(Entrapment efficiency,EE)測定。采用超濾離心法測定脂質(zhì)體的包封率。分別取“2.4”項下脂質(zhì)體溶液各0.5ml,置于10KD超濾離心管中,12000r/min離心60min。將濾液適當(dāng)稀釋,過濾后取20μl進樣,按“2.7.1”項下色譜條件測定外水相中游離藥物的含量。按以下公式計算脂質(zhì)體的包封率。包封率=(投入的總藥量-游離的藥量)/投入的總藥量×100%。結(jié)果所測脂質(zhì)體的包封率均>90%,見表1。

        2.8 體外可剪切試驗

        取適量TAT-DOX-LP及C-TAT-DOX-LP,分別測定其粒徑及電位;加入還原劑二硫蘇糖醇(DTT,10mmol/L)后,同時在37℃水浴中孵育30min,再次測定二者粒徑及電位[DTT(-)表示不加DTT,DTT(+)表示加DTT],結(jié)果見表2。

        表2 不同脂質(zhì)體體外剪切后粒徑及Zeta電位測定結(jié)果(±s,n=3)Tab 2 Particle size and Zeta-potential of different liposomes after cleaved in vitr(ox ±s,n=3)

        表2 不同脂質(zhì)體體外剪切后粒徑及Zeta電位測定結(jié)果(±s,n=3)Tab 2 Particle size and Zeta-potential of different liposomes after cleaved in vitr(ox ±s,n=3)

        脂質(zhì)體類型TAT-DOX-LP C-TAT-DOX-LP粒徑,nm DTT(-)120.8±2.3155.1±2.8DTT(+)122.1±1.2140.5±3.7Zeta電位,mV DTT(-)8.4±0.5-5.9±0.8DTT(+)8.1±0.37.8±0.6

        孵育30min后,TAT-DOX-LP粒徑及電位均無明顯變化,說明DTT本身對粒徑及電位無顯著影響;而C-TAT-DOX-LP的粒徑從155.1nm降低至140.5nm,電位由-5.9mV上升至7.8mV,證實了二硫鍵可在DTT作用下被還原斷裂,暴露出TAT肽。

        2.9 體外釋放試驗

        分別取 C-TAT-DOX-LP、剪切后 C-TAT-DOX-LP(即TAT-DOX-LP)、鹽酸DOX溶液各5ml(DOX質(zhì)量濃度均為5mg/ml)于透析袋中,兩端扎緊后,投入裝有50ml pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的三角瓶中,于(37±0.5)℃的恒溫水平振蕩,頻率為100次/min。分別于 0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24、36、48h取樣1ml,同時補充等體積的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液。收集樣品按“2.7.1”項下色譜條件測定,計算累積釋放度,繪制釋放曲線,見圖5。

        圖5 DOX、C-TAT-DOX-LP及TAT-DOX-LP的體外釋放曲線Fig 5 Accumulative release curves of DOX,C-TAT-DOXLPand TAT-DOX-LPin vitro

        由圖5可見,游離DOX在8h時釋放已達到90%,10h時幾乎已釋放完全;而C-TAT-DOX-LP及TAT-DOX-LP均釋放緩慢持續(xù),無突釋點。對比2組脂質(zhì)體,TAT-DOX-LP釋放DOX有所增加,說明PEG被剪切后有利于DOX的釋放。

        3 討論

        本研究旨在制備C-TAT-DOX-LP。該脂質(zhì)體外層的PEG5000可起到長循環(huán)作用,同時掩蔽TAT肽;在腫瘤組織的還原環(huán)境中,DSPE-S-S-PEG5000中的二硫鍵被還原斷裂,暴露出內(nèi)層的TAT肽,從而促進DOX-LP入胞,增強其抗腫瘤效果。合成部分,采用1H-NMR對DSPE-S-S-PEG5000進行表征,根據(jù)DSPE及PEG的特征質(zhì)子峰鑒定其結(jié)構(gòu),并通過二者峰面積比計算其純度;采用高效液相色譜法檢測TAT肽連接率。結(jié)果表明,本研究所采用的合成方法簡單易行且具有較高的反應(yīng)效率。制備部分,采用經(jīng)典的pH梯度法制備了高EE的DOX-LP,后插入法制備了C-TAT-DOX-LP。后插入法相較于傳統(tǒng)方法簡便、節(jié)省膜材且對EE無明顯影響。體外試驗用濃度為10mmol/L的DTT來模擬腫瘤組織的還原環(huán)境,通過測定C-TAT-DOX-LP粒徑及電位的變化來考察其能否在腫瘤微環(huán)境下暴露TAT肽。結(jié)果顯示,C-TAT-DOX-LP在DTT作用下電荷由負(fù)變正,與TAT-DOX-LP的電位較接近,證明C-TAT-DOX-LP能夠暴露TAT肽,達到了試驗設(shè)計的目的。體外釋放試驗表明,所制備的C-TAT-DOX-LP有明顯緩釋效果,PEG剪切后有利于DOX的釋放。

        綜上所述,本研究成功制備了粒徑均一、包封率高的CTAT-DOX-LP,為下一步考察其抗腫瘤效果奠定了基礎(chǔ)。

        [1] 樊秋平,梁嘉碧,楊海云,等.熱療用多柔比星溫敏納米粒的制備及工藝優(yōu)化[J].中國藥房,2011,22(17):1580.

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