朱亞勤，李玲，胡青，黃發(fā)珍，程亮，程麗芳，陳大為，2#（.蘇州大學藥學院，江蘇蘇州2523；2.沈陽藥科大學，沈陽 006）

多柔比星（DOX）是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物，但是它的毒副作用如骨髓抑制、心臟毒性等限制了其臨床應用[1]。脂質體作為一種新型給藥系統(tǒng)，具有不良反應小、無免疫原性和可生物降解等優(yōu)點。將DOX包裹入脂質體可顯著降低藥物毒性，改善藥物抗腫瘤效果[2]。

TAT肽是一種細胞穿膜肽[3]，其有效序列為AYGRKKRRQRRR，在生理pH下帶正電荷。研究表明，TAT肽可顯著提高脂質體、膠束等的細胞攝取[4]，增強化療藥物的抗腫瘤效果。然而，TAT肽無細胞選擇性，直接與納米載體相連后會降低納米載體在體內的腫瘤靶向性。本研究將可剪切的聚乙二醇（PEG）5000連接在脂質體表面，TAT肽通過PEG2000連接隱藏在內層，構建可剪切PEG及TAT肽共修飾DOX脂質體（C-TAT-DOX-LP），并對其進行表征。

1 材料

RV10旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；Nicomp TM380ZLS粒徑分析儀（美國Nicomp公司）；DeBEE高壓微射流納米均質機（美國Nano DeBEE公司）；SPD-M20A高效液相色譜儀（日本島津公司）。

鹽酸DOX（原料藥，北京華奉聯博科技技術有限公司，批號：HF100622，純度：＞99.5%）；二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（DSPE，上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司，批號：100929，純度：≥99%）；大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，批號：040403，純度：96%）；膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20101215，純度：95%）；TAT-半胱氨酸（TAT-Cys，上海吉爾生化有限公司，批號：P120322-CQ289039，純度：98%）；N-羥基丁二酰亞胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺（NHS-PEG2000-Mal，北京鍵凱科技有限公司，批號：ZZ112P038，純度：95%）；N-琥珀酰-3-2-聯巰基吡啶-丙酸鹽（SPDP，圣克魯斯生物技術上海有限公司，批號：A1912，純度：95%）；甲氧基-聚乙二醇 5000-巰基（CH3O-PEG5000-SH，上海炎怡生物有限公司，批號：B120628，純度：≥95%）；二硫蘇糖醇（DTT，上海前塵生物科技有限公司，批號：233155，純度：≥99.5%）；透析袋（分子質量：8000～14000，上海源葉生物科技有限公司）；氯仿為分析純，乙腈、三氟乙酸為色譜純。

2 方法與結果

2.1 二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-二硫鍵-聚乙二醇5000（DSPE-S-S-PEG5000）的合成與表征

2.1.1 DSPE-S-S-PEG5000的合成。根據參考文獻[5]，DSPES-S-PEG5000的合成步驟如下：稱取20mg DSPE、8.2mg SPDP溶于無水氯仿中，加入適量三乙胺，N2保護，室溫黑暗下攪拌反應5h。薄層色譜（TLC）監(jiān)測反應進程。將80mg Ch3OPEG5000-SH溶解于氯仿反應液，繼續(xù)反應12h，反應結束后，冷乙腈中沉淀除去未反應的DSPE。3000r/min離心5min，上清液旋轉蒸發(fā)除去乙腈，加純水置透析袋中透析48h，凍干。

2.1.2 DSPE-S-S-PEG5000的核磁氫譜（1H-NMR）表征。1HNMR（溶劑：氘代氯仿）表征，DSPE：δ 0.88（t，—CH3，6H），1.25（s，—CH2—，56H），PEG：3.65（s，—CH2—，456H），見圖1。

圖1 DSPE-S-S-PEG5000的1H-NMR圖Fig 1 1H-NMR spectrum of DSPE-S-S-PEG5000

以上特征峰表明PEG5000成功連接到了DSPE上。以δ3.65與δ1.25處峰面積比計算產物純度，結果產物純度約為84.4%。

2.2 DSPE-PEG2000-TAT的合成與表征

2.2.1 DSPE-PEG2000-TAT的合成。根據參考文獻[6]，DSPEPEG2000-TAT的合成方法如下：按物質的量之比1.2∶1稱取DSPE、NHS-PEG2000-Mal溶于無水氯仿中，滴加5μl三乙胺，N2保護，室溫反應5h。TLC監(jiān)測反應進程。反應結束后，旋轉蒸發(fā)除去氯仿，冷乙腈沉淀DSPE，上清液旋轉蒸發(fā)除乙腈。產物透析48h，冷凍干燥。按物質的量之比1∶1.2稱取DSPEPEG2000-Mal、TAT-Cys，溶于純水，N2保護下，輕微攪拌。TLC監(jiān)測反應進程。反應結束后置透析袋中透析48h，冷凍干燥。

2.2.2 DSPE-PEG2000-TAT的紅外光譜（IR）表征。分別取適量TAT-Cys、DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG2000-TAT，加KBr壓片，IR表征見圖2。

圖2 紅外光譜圖a.TAT-Cys；b.DSPE-PEG2000-Mal；c.DSPE-PEG2000-TATFig 2 FTIR spectrumsa.TAT-Cys；b.DSPE-PEG2000-Mal；c.DSPE-PEG2000-TAT

其中，a圖中2556cm－1為TAT-Cys中巰基（—SH）的特征吸收峰，在c圖中該吸收峰消失，b圖中在此位置無吸收峰干擾，證明TAT肽中—SH與DSPE-PEG2000-Mal中的Mal基團已成功連接。b、c圖中2920cm－1、2850cm－1為PEG中C—H伸縮振動，1104cm－1為PEG中C—O伸縮振動，a、c圖中1664cm－1為TAT肽中酰胺鍵C—O伸縮振動，表明已成功合成DSPE-PEG2000-TAT。

2.3 TAT肽連接率的測定

2.3.1 TAT肽含量測定色譜條件。色譜柱：Promosil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A（乙腈+0.1%三氟乙酸）-B（水+0.1%三氟乙酸），梯度洗脫：0～12min，A：12%～37%，B：63%～88%，12～16min，A：37%～100%，B：0～63%；流速：1.0ml/min；檢測波長：220nm；柱溫：30℃；進樣量：20μl。

2.3.2 方法學考察。依法進行精密度和回收率試驗。結果低、中、高水平的日內精密度RSD分別為0.30%、0.67%、0.58%（n＝5），日間精密度RSD分別為1.56%、1.23%、1.31%（n＝5）；回收率分別為（98.68±0.23）% 、（99.49±0.21）%、（99.40±0.43）%，RSD分別為0.62%、0.71%、0.75%（n＝5）。

2.3.3 測定方法。反應前精密稱取TAT-Cys，配制成100μg/ml的溶液，按“2.3.1”項色譜條件進樣20μl，記錄峰面積為A1；反應后取適量反應液稀釋后按相同色譜條件進樣，記錄峰面積為A2，色譜見圖3。

由圖3可見，DSPE-PEG2000-Mal在此條件下對TAT肽無干擾。根據外標一點法計算未反應的TAT肽的量[＝（100×A2×稀釋倍數×反應液體積）/A1]，進一步計算得到TAT肽的連接率[＝（反應前TAT肽的量－反應后TAT肽的量）/TAT肽理論反應量×100%]，經計算為96.3%。

2.4 脂質體的制備

圖3 TAT肽的HPLC色譜圖a.反應前TAT肽；b.反應后TAT肽；c.DSPE-PEG2000-MalFig 3 HPLC chromatograms of TAT peptidea.TAT peptide before reaction；b.TAT peptide after reaction；c.DSPEPEG2000-Mal

采用薄膜分散法及pH梯度法制備DOX脂質體（DOXLP），以后插入法[7]制備TAT肽修飾的DOX-LP（TAT-DOX-LP）、C-TAT-DOX-LP。方法如下：稱取適量大豆卵磷脂、膽固醇溶于無水乙醇，旋轉蒸發(fā)成膜。加入pH 4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，40℃水化20min。所得的脂質體進行超聲粉碎（100W，400s），經高壓微射流處理（20000psi，5min）后得空白脂質體（Blank-LP）溶液。取Blank-LP溶液適量，用0.1mol/L的Na2HPO4溶液調pH至7.6。按藥脂比1∶15稱取DOX溶于pH 7.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，將其緩慢滴加到Blank-LP溶液中，70℃溫浴30min后，立即冷卻，即得DOX-LP，未包封的DOX以透析法除去。取DSPE-S-S-PEG5000、DSPE-PEG2000-TAT各適量溶于pH 7.6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中形成膠束溶液，按物質的量之比分別吸取適量膠束溶液滴入DOX-LP中，55℃條件下溫浴1h，冷卻后即得到C-TAT-DOX-LP，以同樣方法制備TAT-DOX-LP。

2.5 粒徑及Zeta電位的測定

取Blank-LP、DOX-LP、TAT-DOX-LP及C-TAT-DOX-LP各適量，蒸餾水稀釋后用粒徑分析儀測定粒徑及電位。結果，所得脂質體粒徑均在200nm以下，除TAT-DOX-LP帶正電外，其他類型脂質體均帶負電，見表1。

表1 不同脂質體粒徑、電位、包封率測定結果（±s，n＝3）Tab 1 Particle size，Zeta-potential and encapsulation efficiency of different liposomes（±s，n＝3）

表1 不同脂質體粒徑、電位、包封率測定結果（±s，n＝3）Tab 1 Particle size，Zeta-potential and encapsulation efficiency of different liposomes（±s，n＝3）

包封率，%093.5±0.892.1±1.391.8±1.5脂質體類型Blank-LP DOX-LP TAT-DOX-LP C-TAT-DOX-LP粒徑，nm 108.2±2.4116.4±1.4122.1±2.3152.1±1.2Zeta電位，mV－8.6±0.5－14.4±0.78.4±0.4－5.4±0.3

2.6 透射電鏡（TEM）形態(tài)觀察

取DOX-LP及C-TAT-DOX-LP適量，滴加至專用銅網上，樣品干燥后進行TEM掃描，結果見圖4。

由此可見二者在形態(tài)上無明顯差別，分布均勻且呈球形。

2.7 包封率的測定

2.7.1 色譜條件。色譜柱：Promosil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：水（含0.01mol/L磷酸二氫胺）-甲醇（35∶65）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：497nm；進樣量：20μl。

2.7.2 方法學考察。依法進行精密度和回收率試驗。結果低、中、高水平的日內精密度RSD分別為0.43%、0.41%、0.32%（n＝5），日間精密度RSD為0.62%、0.78%、0.58%（n＝5）；回收率分別為（98.75±0.52）%、（98.82±0.31）%、（100.04±0.52）%，RSD分別為0.52%、0.81%、0.63%（n＝5）。

圖42 種脂質體的TEM圖A.DOX-LP；B.C-TAT-DOX-LPFig 4 TEM micrograph of 2kinds of liposomesA.DOX-LP；B.C-TAT-DOX-LP

線性關系考察。標準溶液的制備：精密稱取鹽酸DOX適量，配成1.0mg/ml的母液，然后分別配成1、5、10、20、40μg/ml的溶液。按“2.7.1”項下色譜條件進樣，以峰面積（A）對質量濃度（c）進行回歸，得標準曲線方程A＝12129.4c－1064.5（r＝0.9998）。結果表明，DOX的檢測質量濃度在1～40μg/ml范圍內與峰面積線性關系良好。

2.7.3 包封率（Entrapment efficiency，EE）測定。采用超濾離心法測定脂質體的包封率。分別取“2.4”項下脂質體溶液各0.5ml，置于10KD超濾離心管中，12000r/min離心60min。將濾液適當稀釋，過濾后取20μl進樣，按“2.7.1”項下色譜條件測定外水相中游離藥物的含量。按以下公式計算脂質體的包封率。包封率＝（投入的總藥量－游離的藥量）/投入的總藥量×100%。結果所測脂質體的包封率均＞90%，見表1。

2.8 體外可剪切試驗

取適量TAT-DOX-LP及C-TAT-DOX-LP，分別測定其粒徑及電位；加入還原劑二硫蘇糖醇（DTT，10mmol/L）后，同時在37℃水浴中孵育30min，再次測定二者粒徑及電位[DTT（-）表示不加DTT，DTT（+）表示加DTT]，結果見表2。

表2 不同脂質體體外剪切后粒徑及Zeta電位測定結果（±s，n＝3）Tab 2 Particle size and Zeta-potential of different liposomes after cleaved in vitr（ox ±s，n＝3）

表2 不同脂質體體外剪切后粒徑及Zeta電位測定結果（±s，n＝3）Tab 2 Particle size and Zeta-potential of different liposomes after cleaved in vitr（ox ±s，n＝3）

脂質體類型TAT-DOX-LP C-TAT-DOX-LP粒徑，nm DTT（-）120.8±2.3155.1±2.8DTT（+）122.1±1.2140.5±3.7Zeta電位，mV DTT（-）8.4±0.5－5.9±0.8DTT（+）8.1±0.37.8±0.6

孵育30min后，TAT-DOX-LP粒徑及電位均無明顯變化，說明DTT本身對粒徑及電位無顯著影響；而C-TAT-DOX-LP的粒徑從155.1nm降低至140.5nm，電位由－5.9mV上升至7.8mV，證實了二硫鍵可在DTT作用下被還原斷裂，暴露出TAT肽。

2.9 體外釋放試驗

分別取 C-TAT-DOX-LP、剪切后 C-TAT-DOX-LP（即TAT-DOX-LP）、鹽酸DOX溶液各5ml（DOX質量濃度均為5mg/ml）于透析袋中，兩端扎緊后，投入裝有50ml pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的三角瓶中，于（37±0.5）℃的恒溫水平振蕩，頻率為100次/min。分別于 0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、24、36、48h取樣1ml，同時補充等體積的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液。收集樣品按“2.7.1”項下色譜條件測定，計算累積釋放度，繪制釋放曲線，見圖5。

圖5 DOX、C-TAT-DOX-LP及TAT-DOX-LP的體外釋放曲線Fig 5 Accumulative release curves of DOX，C-TAT-DOXLPand TAT-DOX-LPin vitro

由圖5可見，游離DOX在8h時釋放已達到90%，10h時幾乎已釋放完全；而C-TAT-DOX-LP及TAT-DOX-LP均釋放緩慢持續(xù)，無突釋點。對比2組脂質體，TAT-DOX-LP釋放DOX有所增加，說明PEG被剪切后有利于DOX的釋放。

3 討論

本研究旨在制備C-TAT-DOX-LP。該脂質體外層的PEG5000可起到長循環(huán)作用，同時掩蔽TAT肽；在腫瘤組織的還原環(huán)境中，DSPE-S-S-PEG5000中的二硫鍵被還原斷裂，暴露出內層的TAT肽，從而促進DOX-LP入胞，增強其抗腫瘤效果。合成部分，采用1H-NMR對DSPE-S-S-PEG5000進行表征，根據DSPE及PEG的特征質子峰鑒定其結構，并通過二者峰面積比計算其純度；采用高效液相色譜法檢測TAT肽連接率。結果表明，本研究所采用的合成方法簡單易行且具有較高的反應效率。制備部分，采用經典的pH梯度法制備了高EE的DOX-LP，后插入法制備了C-TAT-DOX-LP。后插入法相較于傳統(tǒng)方法簡便、節(jié)省膜材且對EE無明顯影響。體外試驗用濃度為10mmol/L的DTT來模擬腫瘤組織的還原環(huán)境，通過測定C-TAT-DOX-LP粒徑及電位的變化來考察其能否在腫瘤微環(huán)境下暴露TAT肽。結果顯示，C-TAT-DOX-LP在DTT作用下電荷由負變正，與TAT-DOX-LP的電位較接近，證明C-TAT-DOX-LP能夠暴露TAT肽，達到了試驗設計的目的。體外釋放試驗表明，所制備的C-TAT-DOX-LP有明顯緩釋效果，PEG剪切后有利于DOX的釋放。

綜上所述，本研究成功制備了粒徑均一、包封率高的CTAT-DOX-LP，為下一步考察其抗腫瘤效果奠定了基礎。

[1] 樊秋平，梁嘉碧，楊海云，等.熱療用多柔比星溫敏納米粒的制備及工藝優(yōu)化[J].中國藥房，2011，22（17）：1580.

[2] Wang M，Thanou M.Targeting nanoparticles to cancer[J].Pharmacol Res，2010，62（2）：90.

[3] Qin Y，Chen H，Zhang Q，et al.Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for improving brain delivery and therapeutic eff i cacy on brain glioma in animals[J].Int J Pharm，2011，420（2）：304.

[4] Torchilin VP.Tat peptide-mediated intracellular delivery of pharmaceutical nanocarriers[J].Adv Drug Deliv Rev，2008，60（4/5）：548.

[5] McNeeley KM，Karathanasis E，Annapragada AV，et al.Masking and triggered unmasking of targeting ligands on nanocarriers to improve drug delivery to brain tumors[J].Biomaterials，2009，30（23/24）：3986.

[6] Kuai R，Yuan W，Qin Y，et al.Efficient delivery of payload into tumor cells in a controlled manner by TAT and thiolytic cleavable PEG co-modified liposomes[J].Mol Pharm，2010，7（5）：1816.

[7] Saul JM，Annapragada A，Natarajan JV，et al.Controlled targeting of liposomal doxorubicin via the folate receptor in vitro[J].J Control Release，2003，92（1/2）：49.