史斌，黃厚剛（1.成都市第五人民醫(yī)院麻醉科，成都611130；2.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院麻醉科，重慶402160）

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）是失控的全身炎癥反應綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）在肺部的具體表現(xiàn)[1]。近年研究[2-3]證明，在ALI/ARDS病程中原有的凝血與抗凝、纖溶與抗纖溶、炎癥與抗炎之間的平衡被打破，凝血級聯(lián)與炎癥級聯(lián)之間相互促進，形成一種自動放大的效應，使病情加重。因此干預凝血系統(tǒng)的異常對控制ALI/ARDS的病情發(fā)展具有重要意義。國內(nèi)外有學者通過使用傳統(tǒng)的抗凝藥，如肝素治療ALI/ARDS，取得了改善低氧血癥和減輕炎癥反應的效果[4-5]。類肝素類藥物藻酸雙酯鈉（Polysaccharide sulphate，PSS）系海藻提取物，是一種新型類肝素海洋藥物，其有明顯的改善細胞變形、調(diào)節(jié)血脂代謝、抗凝等作用，同時有較強的分散乳化活性，且不易受外界因素的影響[6]，臨床上主要用于心腦血管疾病的治療，但還未見用于預防ALI/ARDS的報道。本實驗首先采用尾靜脈注射脂多糖（LPS）建立小鼠ALI模型，然后尾靜脈注射PSS，研究ALI/ARDS時PSS對小鼠炎癥因子、信號轉(zhuǎn)導分子的影響，以期為闡明PSS對ALI/ARDS的治療作用及其分子機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

酶標儀（美國Bio-Rad公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；RM2016病理組織切片機（德國Leica公司）；RC 5B高速低溫離心機（美國Sorvall公司）。

1.2 藥品與試劑

PSS原料藥（中國青島海爾藥業(yè)公司，批號：20080405，純度：99.9%）；大腸埃希菌LPS（美國Sigma公司，批號：20060814S）；肺組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（NF-κB p65）免疫組化試劑盒（美國邁新公司）；細胞間黏附因子1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）。

1.3 動物

健康C57BL/6小鼠40只，♂，體質(zhì)量20～30g，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心，合格證編號：SCXK（鄂）2008-0015。實驗前禁食12h，自由飲水。

2 方法

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機分為4組，每組10只。對照組，尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）；PSS組，根據(jù)文獻[7]報道尾靜脈注射PSS 10mg/kg；模型組，尾靜脈注射LPS 10mg/kg；治療組，先尾靜脈注射LPS 10mg/kg后立即尾靜脈注射PSS 10mg/kg。各組液體注射總量按10～20ml/kg給予。

2.2 檢測指標

各組小鼠注射給藥8h后，斷頸法處死，立即打開胸腔，切取肺組織，取右肺上葉稱質(zhì)量，取左肺置于4%多聚甲醛溶液中固定，其余肺組織置入液氮中速凍后，－80℃冰箱保存。

2.2.1 肺組織濕干質(zhì)量比值（W/D）。取各組小鼠右肺上葉肺組織用吸水紙吸干表面水分及血液后，稱濕質(zhì)量（W）后，置于94℃干燥箱內(nèi)烘烤48h至恒質(zhì)量，再稱干質(zhì)量（D），計算肺組織W/D。

2.2.2 肺組織形態(tài)學。取經(jīng)固定后的每組小鼠的左肺組織，乙醇系列脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚度3μm，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學變化。

2.2.3 肺組織中TNF-α、ICAM-1的濃度。取各組小鼠冰凍肺組織100mg，充分勻漿，離心后取上清液，采用ELISA法測定肺組織中TNF-α和ICAM-1的濃度，具體按試劑盒要求操作。

2.2.4 肺組織中NF-κB p65活性。采用免疫組化法，按試劑盒說明書操作，加入兔抗NF-κB p65抗體（1∶200），陰性對照采用正常山羊血清代替，以光密度（OD）值為指標檢測各組小鼠肺組織中NF-κB p65活性。采用圖像分析法，通過顯微鏡放大10×10倍攝取圖像，觀察細胞著色情況，著色越明顯，NF-κB p65表達強度越高。

2.3 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 肺組織W/D變化

與對照組比較，模型組、治療組小鼠肺組織的W/D均明顯增加（P＜0.05）；PSS組小鼠肺組織的W/D差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，治療組小鼠肺組織的W/D明顯減小（P＜0.05），具體結(jié)果詳見表1。

3.2 肺組織形態(tài)學變化

表1 各組小鼠肺組織W/D及ICAM-1、TNF-α、NF-κB p65水平比較（±s，n＝10）Tab 1Comparison of W/D and ICAM-1，TNF-α and NF-κB p65levels in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

表1 各組小鼠肺組織W/D及ICAM-1、TNF-α、NF-κB p65水平比較（±s，n＝10）Tab 1Comparison of W/D and ICAM-1，TNF-α and NF-κB p65levels in lung tissue of mice in each group（±s，n＝10）

與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別對照組PSS組模型組治療組W/D 4.13±0.234.21±0.245.35±0.37＊5.05±0.33＊#ICAM-1，ng/L 59.4±7.461.6±7.1185.5±18.8＊75.5±14.5＊#TNF-α，ng/L 258.5±15.7278.4±23.3522.3±35.4＊405.2±26.6＊#NF-κB p65，ng/L 187.25±21.41190.58±19.34256.42±24.45＊＊225.91±20.12＊##

對照組和PSS組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔適中，無水腫、炎癥，肺泡腔清晰；模型組小鼠肺泡間隔增寬，肺泡壁破壞，肺間質(zhì)水腫，部分肺泡融合，腔內(nèi)可見滲出、水腫及出血，肺間質(zhì)炎細胞浸潤；治療組小鼠肺組織上述病理變化較模型組明顯改善，肺泡壁破壞減少，出血及滲出減輕。顯微鏡圖見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化（HE，×100）A.對照組；B.PSS組；C.模型組；D.治療組Fig 1 Pathological change of lung tissue of mice in each grou（pHE，×100）A.control group；B.PSS group；C.model group；D.treatment group

3.3 肺組織中ICAM-1、TNF-α的濃度變化

與對照組比較，模型組、治療組小鼠肺組織中ICAM-1、TNF-α濃度均明顯增加（P＜0.05），PPS組小鼠肺組織中上述指標的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，治療組小鼠肺組織中ICAM-1、TNF-α濃度均明顯減?。≒＜0.05），具體結(jié)果詳見表1。

3.4 肺組織中NF-κB p65活性變化

鏡下觀察，對照組和PSS組小鼠肺組織中NF-κB p65表達主要集中在肺泡和巨噬細胞等中，呈淺黃色，以胞漿為主；模型組小鼠肺組織中NF-κB p65表達主要集中在炎癥細胞和支氣管上皮細胞等中，胞漿和胞核的著色明顯加深，呈棕黃色，且胞核染色明顯增多，表達的強度與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，治療組小鼠肺組織中NF-κB p65表達明顯降低（P＜0.01），結(jié)果見表1，顯微鏡圖見圖2。

4 討論

圖2 各組小鼠肺組織中NF-κB p65的染色情況（×400）A.對照組；B.PSS組；C.模型組；D.治療組Fig 2 Staining of NF-κB p65in lung tissue of mice in each grou（p×400）A.control group；B.PSS group；C.model group；D.treatment group

內(nèi)毒素是ALI的主要致病因素之一，是革蘭陰性菌細胞外膜成分，其主要致病物質(zhì)LPS，具有嚴重的致炎作用。目前認為在ALI/ARDS早期，血管內(nèi)皮細胞以及單核巨噬細胞在LPS的誘導下可表達TNF-α等細胞因子以及ICAM-1等多種黏附分子。TNF-α和ICAM-1介導多形核白細胞（PMN）與肺微血管內(nèi)皮細胞黏附后，既可激活PMN釋放彈性蛋白酶等炎性介質(zhì)降解肺微血管內(nèi)皮細胞（PMVEC）結(jié)構(gòu)蛋白[8]，又能啟動ICAM-1信號轉(zhuǎn)導重構(gòu)PMVEC細胞骨架[9]，致使PMVEC正常的細胞結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，通透性增加，形成滲透性肺水腫，導致肺順應性下降和氧合障礙，引發(fā)內(nèi)毒素性ALI。

NF-κB在細胞質(zhì)中與其抑制蛋白IκB結(jié)合以非活性異二聚體形式存在，受細胞因子TNF-α或細菌、病毒、缺氧等刺激后，導致IκB磷酸化而降解。IκB降解使NF-κB游離，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，與靶基因上的κB位點結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮一系列細胞效應[10]。本研究在給予LPS后8h，免疫組化定位顯示NF-κB活化轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，上調(diào)TNF-α和ICAM-1濃度，這與文獻[11]結(jié)果一致。給予治療劑量的PPS后，抑制了NF-κB p65的活化，說明PPS對ALI模型小鼠的保護作用通過抑制NF-κB p65細胞信號通路發(fā)揮效應。

與對照組比較，PSS組小鼠未見明顯的肺損傷以及TNF-α、ICAM-1和NF-κB的相應改變，說明在實驗劑量（10mg/kg）內(nèi)對小鼠無明顯副作用。

綜上所述，PPS能對LPS誘導的ALI模型小鼠具有保護作用，可能是通過抑制NF-κB p65的活化、下調(diào)TNF-α和ICAM-1濃度而發(fā)揮作用。但相關(guān)的具體作用機制以及其保護作用與劑量的相關(guān)性有待進一步的研究。

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