李 霞，周望溪，席美鳳（湖南永州市中心醫(yī)院北院藥劑科，湖南永州 425000）

他莫昔芬（Tamoxifen）是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，被廣泛應(yīng)用于治療乳腺癌和婦科惡性腫瘤[1-3]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究[4-5]表明，43%的患者在使用他莫昔芬后兩年內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，并可能進(jìn)一步發(fā)展為脂肪型肝炎和肝硬化。近年來關(guān)于他莫昔芬導(dǎo)致脂肪肝的體外分子機(jī)制研究報(bào)道較少。本研究擬通過建立他莫昔芬誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生脂質(zhì)沉積模型，探討他莫昔芬對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成與代謝途徑的影響，并進(jìn)一步明確其導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積可能的分子機(jī)制，為選擇和開發(fā)治療乳腺癌和婦科腫瘤更加安全和有效的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

CFX96TM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BX51顯微鏡（日本Olympus公司）。

他莫昔芬原料藥（批號(hào)：T5648，純度：≥99%）和棕櫚酸原料藥（批號(hào)：57-10-3，純度：≥99%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)公司，批號(hào)：15596026）；乙酰輔酶A羧化酶（ACC）一抗及其磷酸化（PACC）一抗（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab63531、ab31931）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗、MTT試劑（中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：A0208、ST316）；1640培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SH30809.01B、SV300087.02）。

人肝癌HepG2細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后接種于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、CO2孵育箱中，2d換液1次，傳代至第3代時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 HepG2細(xì)胞增殖檢測(cè)

將HepG2細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為每孔6000個(gè)，分為6組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組為不作處理的細(xì)胞，另外5組分別為用0.5、1、5、15、30μmol/L他莫昔芬處理后的細(xì)胞。培養(yǎng)48h后每孔加入20μl的MTT試劑（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150μl的二甲基亞砜，充分混勻后用酶標(biāo)儀于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（OD）值。OD值越大，則表明細(xì)胞增殖越明顯。

2.3 HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積檢測(cè)

將HepG2細(xì)胞接種于爬片，分為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組（200μmol/L棕櫚酸溶液[6]）和0.5、1、5μmol/L他莫昔芬組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入相應(yīng)藥物處理細(xì)胞誘導(dǎo)脂質(zhì)沉積。各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后吸棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10min，油紅O染色20min，以質(zhì)量比為60%的異丙醇分化，蘇木素復(fù)染胞核。400倍顯微鏡下觀察各組細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況，以細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯增多表示脂質(zhì)沉積明顯。

2.4 HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪酸（FA）合成、氧化相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)

將HepG2細(xì)胞接種于6孔板，分為空白對(duì)照組和他莫昔芬（5μmol/L）組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)藥物處理細(xì)胞，培養(yǎng)12h后，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FA合成酶（FAS）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（Srebp-1c）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的表達(dá)和FA氧化相關(guān)基因過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）和解偶聯(lián)蛋白2（UCP-2）的表達(dá)。引物采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，F(xiàn)AS上 游 序 列 ：5′-CGCTCGGCATGGCTATCT-3′，下 游 序 列 ：5′-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3′；ACC 上游序列：5′-ATCCGCGGCTATATGAAAACA-3′，下游序列：5′-TCGTAGTGGGCTTGCTGAAA-3′；Srebp-1c上游序列：5′-CGGAACCATCTTGGCAACA-3′，下 游 序 列 ：5′-GCCGGTTGATAGGCAGCTT-3′；PPAR-α上游序列：5′-GGGCACCTGGAGGTATCGT-3′，下 游 序 列 5′-GGGACCCTTATCAATCCTAATCATT-3′；UCP-2上游序列：5′-CCATCTCCTGGGACGTAGCA-3′，下游序列：5′-GGCACATCTGTGGCCTTGA-3′。以他莫昔芬組各基因表達(dá)與空白對(duì)照組各基因表達(dá)的比值為指標(biāo)。

2.5 HepG2細(xì)胞內(nèi)ACC和P-ACC蛋白表達(dá)檢測(cè)

將HepG2細(xì)胞接種于6孔板，分為空白對(duì)照組和他莫昔芬（5μmol/L）組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)藥物處理細(xì)胞，培養(yǎng)12h后，分別加入適量的蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。依次進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入ACC和P-ACC一抗4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗孵育1h，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，凝膠成像儀采集圖像，結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件分析。各組數(shù)據(jù)用±s表示，結(jié)果采用方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 HepG2細(xì)胞增殖情況

與空白對(duì)照組比較，0.5、1、5μmol/L他莫昔芬對(duì)HepG2細(xì)胞增殖無明顯影響（P＞0.05），15、30μmol/L他莫昔芬能明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖（P＜0.05）。各組HepG2細(xì)胞增殖情況比較見表1。

表1 各組HepG2細(xì)胞增殖情況比較（±s，n＝3）Tab 1 Comparison of the proliferation of HepG2cells of each group（±s，n＝3）

表1 各組HepG2細(xì)胞增殖情況比較（±s，n＝3）Tab 1 Comparison of the proliferation of HepG2cells of each group（±s，n＝3）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05

OD值1.03±0.041.01±0.050.99±0.080.96±0.090.81±0.02＊0.67±0.05＊組別空白對(duì)照組0.5μmol/L他莫昔芬組1μmol/L他莫昔芬組5μmol/L他莫昔芬組15μmol/L他莫昔芬組30μmol/L他莫昔芬組

3.2 HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況

空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞未作任何處理，故細(xì)胞內(nèi)無明顯脂質(zhì)沉積。與空白對(duì)照組比較，5μmol/L他莫昔芬組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯增多，表明出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，且與陽性對(duì)照組相似；而0.5、1μmol/L他莫昔芬組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積不明顯。各組HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積顯微鏡圖見圖1。

3.3 HepG2細(xì)胞內(nèi)FA合成、氧化相關(guān)基因的表達(dá)情況

圖1 各組HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積顯微鏡圖（×400）A.空白對(duì)照組；B.0.5μmol/L他莫昔芬組；C.1μmol/L他莫昔芬組；D.5μmol/L他莫昔芬組；E.陽性對(duì)照組Fig 1 Microscopic images of lipid accumulation of HepG2cells of each grou（p×400）A.blank control group；B.0.5μmol/L tamoxifen group；C.1μmol/L tamoxifen group；D.5μmol/L tamoxifen group；E.positive control group

與空白對(duì)照組（1.00±0）比較，他莫昔芬組細(xì)胞內(nèi)FAS（1.37±0.08）mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05），ACC（1.02±0.18）、Srebp-1c（0.94±0.07）、PPAR-α（0.93±0.06）和 UCP-2（0.93±0.06）mRNA表達(dá)無明顯變化。提示他莫昔芬可通過通過增加FA的合成來增加HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積，F(xiàn)A的氧化對(duì)減少HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積起著重要作用。

3.4 HepG2細(xì)胞內(nèi)ACC和P-ACC蛋白表達(dá)情況

與空白對(duì)照組比較，他莫昔芬組細(xì)胞內(nèi)ACC蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），P-ACC蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。兩組HepG2細(xì)胞內(nèi)ACC、P-ACC蛋白表達(dá)電泳圖見圖2，表達(dá)量比值比較見圖3。

圖3 兩組HepG2細(xì)胞內(nèi)ACC/P-ACC蛋白表達(dá)量比值比較與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05Fig 3 Comparison of protein expression ratio of ACC to PACC in HepG2cells of 2groupsvs.blank control group：＊P＜0.05

圖2 兩組HepG2細(xì)胞內(nèi)ACC、P-ACC蛋白表達(dá)電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of protein expression of ACC and P-ACC in HepG2cells of 2groups

4 討論

在NAFLD病理過程中，一般伴有肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂，富余脂質(zhì)尤其是甘油三酯（TG）的沉積是NAFLD形成發(fā)展的先決條件[7]。在本試驗(yàn)中，空白對(duì)照組與他莫昔芬組均未給予外部FA刺激，5μmol/L他莫昔芬組HepG2細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積，提示給予他莫昔芬刺激HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞自身合成FA可能是增加的。因此本研究檢測(cè)了ACC、FAS、Srebp-1c mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果5μmol/L他莫昔芬組細(xì)胞內(nèi)FAS mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)。FAS是合成FA的關(guān)鍵酶，位于細(xì)胞漿內(nèi)，普遍表達(dá)于肝、腎、腦、肺等組織中，特別是肝臟組織[8]。FAS在催化內(nèi)源性長(zhǎng)鏈FA合成過程中起著重要作用。ACC是FA重頭合成的限速酶，其79位的絲氨酸去磷酸化能使ACC激活，導(dǎo)致FA合成增加[9-10]。因此本研究檢測(cè)了ACC及P-ACC蛋白表達(dá)，根據(jù)結(jié)果表明5μmol/L他莫昔芬組細(xì)胞內(nèi)P-ACC蛋白表達(dá)明顯降低。由此導(dǎo)致的肝臟自身合成FA增加可能是FA蓄積的原因之一。

此外，正常有效的FA氧化對(duì)減少HepG2細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積是必要的。FA代謝關(guān)鍵調(diào)控因子及其控制的關(guān)鍵酶，在FA氧化中都起重要作用，其表達(dá)和功能發(fā)生異常，也是造成FA代謝紊亂主要原因之一[11]。因此本研究檢測(cè)了FA氧化相關(guān)基因PPAR-α、UCP-2，結(jié)果空白對(duì)照組與5μmol/L他莫昔芬組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，本次研究首次通過體外細(xì)胞模型觀察到他莫昔芬能夠通過增加FA合成來導(dǎo)致HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積，抑制P-ACC水平是其可能的作用機(jī)制之一，為進(jìn)一步明確其副作用機(jī)制和開發(fā)新藥提供了理論基礎(chǔ)。

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