鄧守恒，王賢和，袁選舉，李 芳，李林均，陳 萍（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北十堰442000）

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。近年來，人們圍繞這一難題進(jìn)行了大量的研究，主要采用的方法有化學(xué)藥物干預(yù)和基因治療等。維拉帕米和環(huán)孢霉素A是被研究最多的化學(xué)藥物，但由于其毒副作用大、特異性差，實際應(yīng)用中效果并不理想。而基因治療也存在著易被DNA酶降解、治療效果不能持久等問題，從而使其臨床應(yīng)用受限。硒化殼聚糖是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下，以混合金屬離子為催化劑，通過拼合原理制備成的有機(jī)硒，具有高效低毒的特性[1]。硒和砷在化學(xué)周期表中屬同族，研究[2-3]證實砷劑能恢復(fù)部分耐藥腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，推測硒劑也應(yīng)具有相似的作用，本文對此進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器

BMP型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；Mod 550型全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

硒化殼聚糖（本院化學(xué)系合成，批號：100601-201016，硒含量：0.8%）；多柔比星（Doxorubicin，DOX）注射用粉末（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：090606，規(guī)格：每支10mg）；MTT、甲基纖維素（美國Sigma公司）；磷酸化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt）多克隆抗體及二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.3 細(xì)胞

人慢性粒細(xì)胞白血病（CML）耐DOX細(xì)胞株（K562/DOX）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

K562/DOX細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和2u/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，在培養(yǎng)體系中加入終質(zhì)量濃度為0.6μg/ml的DOX以維持其耐藥性，于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)，每隔3～4d傳代1次。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞抑制率

收集指數(shù)生長期的K562/DOX細(xì)胞以全培養(yǎng)液稀釋成5×104ml－1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)12h，將細(xì)胞分為陰性對照組（RPMI 1640培養(yǎng)基）、DOX組（50μg/ml DOX）和25、50、100、200、400μg/ml硒化殼聚糖組（50μg/ml DOX+相應(yīng)濃度的硒化殼聚糖），每組4個復(fù)孔。各組加樣后繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36h，每孔加入MTT 10μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄上清，加入200μl二甲基亞砜（DMSO），酶標(biāo)儀檢測570nm波長處光密度（OD）值并計算細(xì)胞抑制率。試驗重復(fù)3次，比較各組細(xì)胞抑制率的差異并計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。細(xì)胞抑制率（%）＝（1－硒化殼聚糖組OD值/陰性對照組OD值）×100%；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝硒化殼聚糖組半數(shù)抑制率/DOX組半數(shù)抑制率。

2.3 克隆形成法檢測細(xì)胞存活率

參照文獻(xiàn)[4]配制半固體培養(yǎng)基，收集“2.2”項下各組作用12h的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去藥物，1000r/min離心3min，用含20%胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋成7.0×103ml－1單細(xì)胞懸液，于預(yù)先每孔加入1.2%甲基纖維素培養(yǎng)基1.0ml的24孔板中，加入單細(xì)胞懸液50μl，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。混勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12～14d，于倒置相差顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，計算細(xì)胞存活率（DOX組或硒化殼聚糖組平均克隆數(shù)/陰性對照組平均克隆數(shù)×100%）。試驗重復(fù)3次，比較各組細(xì)胞存活率的差異。

2.4 免疫印跡法測定p-Akt蛋白的表達(dá)

細(xì)胞分組方法同“2.2”項，即分為DOX組（50μg/ml DOX）和100、200μg/ml硒化殼聚糖組（50μg/ml DOX+相應(yīng)濃度的硒化殼聚糖），作用24h后收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細(xì)胞總蛋白。進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液中，煮沸，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)膜。依次加入p-Akt多克隆抗體及二抗，顯色，拍照，Quanti Scan軟件進(jìn)行密度掃描分析。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，比較各組細(xì)胞p-Akt蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值比值的差異。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞抑制率和存活率檢測結(jié)果

MTT法檢測結(jié)果顯示，DOX組對K562/DOX細(xì)胞的抑制作用有限，作用12、24、36h的抑制率分別為28.17%、36.72%、40.14%，說明細(xì)胞對DOX確實存在耐藥。25～400μg/ml硒化殼聚糖組對K562/DOX細(xì)胞的抑制作用明顯高于DOX組，且與濃度、時間呈正相關(guān)。25、50、100、200、400μg/ml硒化殼聚糖組作用12h，對K562/DOX細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別是1.11、1.57、1.68、2.09、2.51，說明硒化殼聚糖能逆轉(zhuǎn)K562/DOX細(xì)胞對DOX的耐藥，對細(xì)胞增殖產(chǎn)生了明顯的抑制作用?？寺⌒纬煞z測結(jié)果也顯示，DOX與硒化殼聚糖聯(lián)用，對細(xì)胞克隆形成有明顯的抑制作用，細(xì)胞存活率與DOX組比較明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈一定的量效關(guān)系。各組作用不同時間后細(xì)胞的抑制率見圖1；各組作用12h后細(xì)胞的抑制率、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)、存活率比較見表1。

圖1 各組作用不同時間后K562/DOX細(xì)胞的抑制率與DOX組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 1 Proliferative inhibitory rate of K562/DOX cells effected for different time in each groupvs.DOX group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表1 各組作用12h后K562/DOX細(xì)胞的抑制率、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)、存活率比較（±s，n＝4）Tab 1 Proliferative inhibitory rate，reversal multiple，survival rate of K562/DOX cells effected for 12h in each group（±s，n＝4）

表1 各組作用12h后K562/DOX細(xì)胞的抑制率、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)、存活率比較（±s，n＝4）Tab 1 Proliferative inhibitory rate，reversal multiple，survival rate of K562/DOX cells effected for 12h in each group（±s，n＝4）

與DOX組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.DOX group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

存活率，%73.21±3.1260.16±4.14＊49.23±3.37＊＊38.49±4.35＊＊25.62±3.29＊＊12.84±1.83＊＊逆轉(zhuǎn)倍數(shù)組別DOX組25μg/ml硒化殼聚糖組50μg/ml硒化殼聚糖組100μg/ml硒化殼聚糖組200μg/ml硒化殼聚糖組400μg/ml硒化殼聚糖組抑制率，%28.17±3.1431.14±2.8744.25±4.18＊47.52±4.69＊＊59.16±5.43＊＊70.97±9.58＊＊1.111.571.682.092.51

3.2 細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)情況

結(jié)果顯示，DOX組細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白呈高表達(dá)（灰度比值為0.9917±0.29），細(xì)胞經(jīng)100、200μg/ml硒化殼聚糖作用24h后，細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)的灰度比值分別為（0.4982±0.24）、（0.3714±0.33）。與DOX組比較，100、200μg/ml硒化殼聚糖組細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），即下調(diào)（42.76±2.21）%、（62.17±3.44）%。3組細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2。

4 討論

圖2 3組K562/DOX細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of the protein expression of p-Akt in K562/DOX cells in 3groups

CML是以費(fèi)城（Ph）染色體為特征的多潛能干細(xì)胞異常的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。Ph染色體是由位于9號染色體上的c-abl基因與位于22號染色體上的bcr基因相互異位，產(chǎn)生bcr-abl融合基因，該基因編碼的融合蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，可使融合蛋白自身及細(xì)胞內(nèi)多種底物分子磷酸化，從而激活包括Ras/促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在內(nèi)的多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的分裂與增殖，與CML的發(fā)病及耐藥密切相關(guān)[5]。故而降低CML細(xì)胞內(nèi)融合蛋白含量、抑制其酪氨酸激酶活性、阻斷其可能的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，已成為當(dāng)前針對分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療的策略之一。

筆者前期研究結(jié)果顯示，硒化殼聚糖可通過下調(diào)NF-κB通路對體外培養(yǎng)的CML細(xì)胞株K562增殖產(chǎn)生抑制[6]，且可對細(xì)胞特征性的P210融合蛋白產(chǎn)生明顯的下調(diào)作用[7]，提示硒化殼聚糖可能會對K562耐藥細(xì)胞產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用。本文中，筆者以DOX誘導(dǎo)建立的K562/DOX為研究對象，采用經(jīng)典的MTT法和克隆形成法檢測了硒化殼聚糖對K562/DOX細(xì)胞體外增殖和存活的影響。結(jié)果顯示，單純DOX對細(xì)胞的抑制效果有限，而與不同濃度硒化殼聚糖聯(lián)用后，DOX對細(xì)胞的抑制率明顯高于DOX組，且呈現(xiàn)出一定的量效和時效關(guān)系，說明硒化殼聚糖具有逆轉(zhuǎn)K562/DOX細(xì)胞耐DOX的作用。

磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）是磷脂酰肌醇依賴激酶家族成員，參與細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞骨架構(gòu)筑等的調(diào)控[8]；Akt是PI-3K最主要的靶酶，與多種細(xì)胞活動、物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)有關(guān)，尤其與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生存有密切關(guān)系[9]。已有研究[10]表明，部分腫瘤細(xì)胞可以通過對負(fù)責(zé)細(xì)胞生長和凋亡的細(xì)胞信息傳導(dǎo)通路（如Akt和NF-κB通路）進(jìn)行調(diào)控，從而獲得對化療藥物的耐藥性。本文研究結(jié)果則進(jìn)一步證實了在耐藥的K562/DOX細(xì)胞內(nèi)存在著PI-3K/Akt信號通路的異常激活，而硒化殼聚糖則能通過下調(diào)p-Akt水平對PI-3K/Akt信號通路產(chǎn)生抑制進(jìn)而逆轉(zhuǎn)K562/DOX細(xì)胞對DOX的耐藥。

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