張 鵬，廉江平，方志遠(yuǎn)，李小川

酮咯酸氨丁三醇為非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，屬于吡咯烷羧酸衍生物。本品經(jīng)口服或注射被人體吸收后轉(zhuǎn)化成酮咯酸發(fā)揮其抗炎鎮(zhèn)痛作用，因其具有抑制花生四烯酸或膠原誘發(fā)的血小板聚集作用，故與其他非甾體抗炎藥物的作用機(jī)制類似。酮咯酸氨丁三醇的鎮(zhèn)痛活性較強(qiáng)，能有效緩解各類軟組織、肌肉以及關(guān)節(jié)的中度疼痛。因其兼具迅速強(qiáng)效、非成癮、非麻醉性等優(yōu)勢(shì)，故在臨床上應(yīng)用廣泛［1-2］。國內(nèi)外目前對(duì)酮咯酸氨丁三醇的注射劑、普通片劑、膠囊劑、滴眼劑等應(yīng)用研究較多，但酮咯酸氨丁三醇分散片作為一種新劑型，具有較其他口服制劑吸收迅速、快速起效，較注射劑使用方便、快捷的特點(diǎn)。目前國內(nèi)還沒有對(duì)酮咯酸氨丁三醇分散片進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)的研究［3］。本研究建立了RP-HPLC法測(cè)定人血漿中酮咯酸氨丁三醇的濃度，通過比較健康志愿者分別口服分散片與膠囊劑后的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，評(píng)價(jià)兩者的生物等效性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-10ATvp高效液相色譜儀(包括2010A自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M10Avp二極管陣列檢測(cè)器，LCsolution色譜工作站，島津公司);AS3120A超聲震蕩器(奧特賽恩斯公司);TEX-6渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);PHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);IDL-5-A冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品與試劑 酮咯酸氨丁三醇分散片(受試制劑，10 mg/片，批號(hào):070601);酮咯酸氨丁三醇膠囊(參比制劑，10 mg/粒，批號(hào):070601);酮咯酸氨丁三醇對(duì)照品(純度99.8%，批號(hào):061101)均由山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司提供;空白人血漿(西安市中心血站);甲醇(色譜純，TEDIA公司)，硫酸、氫氧化鈉、磷酸、磷酸二氫鉀、正己烷、乙醚等均為分析純，蒸餾水為雙蒸水。

2 方法

2.1 受試對(duì)象 臨床試驗(yàn)方案經(jīng)過我院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。選擇健康成年男性志愿者進(jìn)行全面的體格檢查，對(duì)肝、腎功能項(xiàng)目進(jìn)行化驗(yàn)，并進(jìn)行心電圖、血壓等檢查。18名志愿者年齡為(22.1±1.5)歲，身高為(173.3±3.2)cm，體重(66.2±5.8)kg，在標(biāo)準(zhǔn)體重的±10%之內(nèi)，體檢結(jié)果正常，無藥物過敏史及既往病史，精神狀態(tài)良好。受試者在試驗(yàn)前簽署知情同意書，并在試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用其他藥物。受試期間禁煙、酒、茶，清淡飲食，并限制其進(jìn)行劇烈活動(dòng)。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與血樣采集 采用雙周期、自身交叉單次服藥的對(duì)照試驗(yàn)設(shè)計(jì)。隨機(jī)將18例受試者分為人數(shù)相等的兩組。在試驗(yàn)前一日晚入院禁食12 h后，于翌日清晨8∶00空腹用220 mL溫開水送服參比制劑或受試制劑20 mg，服藥后2 h方可飲水，在服藥后4 h和10 h進(jìn)統(tǒng)一的低脂標(biāo)準(zhǔn)餐。醫(yī)師負(fù)責(zé)對(duì)受試者進(jìn)行臨床監(jiān)護(hù)，藥學(xué)專業(yè)人員控制采血時(shí)間，護(hù)士負(fù)責(zé)采血工作。受試者分別于服藥前和服藥后 0.17、0.33、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0 h 采上肢靜脈血4 mL，加入到肝素抗凝的離心管中，室溫條件下靜置15 min后，冷凍離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，傾出上層血漿，保存于-20℃冰箱中用于日后測(cè)定。經(jīng)過間隔7 d的清洗期后，兩組受試者交叉服用與上一周期不同的酮咯酸氨丁三醇制劑，并嚴(yán)格按照上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)的規(guī)定服藥及采血。

2.3 血藥濃度測(cè)定

2.3.1 血漿樣品的處理 待測(cè)血漿室溫融化，靜置10 min后，取具塞試管，加入血樣0.5 mL及0.6 mol/L硫酸溶液 200 μL，渦旋混勻;加入4.0 mL乙醚，渦旋振蕩，充分提取后，于4 500 r/min離心5 min，吸取上層2.5 mL有機(jī)層置尖底離心管中，于40℃恒溫水浴條件下氮?dú)獯蹈?，吸? mL正己烷充分溶解管中殘留物，并精密加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液200 μL振蕩混合，于4 500 r/min離心5 min，分取水層，精密加入0.6 mol/L硫酸溶液50 μL，充分混勻，濾膜過濾后，取50 μL進(jìn)樣測(cè)定。

2.3.2 色譜條件 色譜柱為Hypersil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，Thermo Quest公司)，流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH=2.5)-甲醇(55∶45);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長為321 nm。柱溫:室溫。

2.3.3 方法的專屬性 按照“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件，受試者的空白血漿樣品、標(biāo)準(zhǔn)品及用藥后的血漿色譜圖見圖1。酮咯酸氨丁三醇的保留時(shí)間約為10.1 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)酮咯酸氨丁三醇的測(cè)定無干擾。

圖1 HPLC法測(cè)定血漿中酮咯酸氨丁三醇的色譜圖

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取空白血漿1.0 mL，加酮咯酸氨丁三醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL，配制成質(zhì)量濃度為 49.50、99.00、247.50、495.00、990.00、1 980.00和3 960.00 ng/mL的血漿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣 50 μL，記錄色譜圖。以藥物質(zhì)量濃度(C)為縱坐標(biāo)、色譜峰面積(A)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:C=0.005 9 A+5.29(n=7)，r=0.999 9，表明酮咯酸氨丁三醇血漿濃度在 49.50～3 960.00 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)濃度為49.50 ng/mL。

2.3.5 方法回收率和精密度 取空白血漿1.0 mL，按“2.3.4”項(xiàng)下方法配制酮咯酸氨丁三醇低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(分別為 49.50、495.00、1 980.00 ng/mL)的血漿質(zhì)控樣品(n=5)，連續(xù)測(cè)定5 d，每日做一條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄色譜圖，將色譜峰面積代入到當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算血漿質(zhì)控樣品的測(cè)得濃度，與配制濃度進(jìn)行比較，計(jì)算該方法的日間和日內(nèi)精密度，數(shù)據(jù)見表1。

2.3.6 絕對(duì)回收率 取空白血漿1.0 mL，加入適量酮咯酸氨丁三醇標(biāo)準(zhǔn)溶液使血漿質(zhì)量濃度分別為 99.00、495.00、1 980.00 ng/mL，按血漿樣品的處理及血藥濃度測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，另取酮咯酸氨丁三醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，不經(jīng)提取過程直接進(jìn)樣，以其所得色譜峰面積作為標(biāo)準(zhǔn)。前述3種不同質(zhì)量濃度的血漿樣品測(cè)定所得色譜峰面積結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)相比為絕對(duì)回收率。結(jié)果見表1。

表1 三種不同質(zhì)量濃度的血漿樣品的絕對(duì)回收率

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白血漿1.0 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為495.00 ng/mL的酮咯酸氨丁三醇血漿質(zhì)控樣品，考察質(zhì)控樣品在室溫放置24 h、-20℃條件下凍融循環(huán)3次、-20℃條件下冷凍15 d，以及血漿質(zhì)控樣品中的酮咯酸氨丁三醇提取溶液在室溫條件下24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。在4種穩(wěn)定性考察條件下，其RSD值分別為3.35%、3.85%、3.67%、3.45%，說明酮咯酸氨丁三醇血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好。

2.3.8 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算 數(shù)據(jù)結(jié)果由中國藥科大學(xué)編制的藥代動(dòng)力學(xué)軟件BAPP 2.0計(jì)算生成，Tmax和Cmax采用實(shí)測(cè)值，采用半對(duì)數(shù)作圖法，由消除相末端的濃度點(diǎn)即直線斜率計(jì)算t1/2，計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，使用梯形法計(jì)算藥-時(shí)曲線下面積AUC值，求出受試制劑相對(duì)生物利用度F。

3 結(jié)果

3.1 藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù) 18例受試者分別口服酮咯酸氨丁三醇分散片和膠囊后平均藥-時(shí)曲線見圖1，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。

圖2 受試者分別口服分散片和膠囊后平均血藥濃度-時(shí)間曲線

表2 口服分散片和膠囊后受試者血漿中酮咯酸氨丁三醇藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n=18)

表2 口服分散片和膠囊后受試者血漿中酮咯酸氨丁三醇藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s，n=18)

注:兩組比較，P＞0.05

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3.2 生物等效性評(píng)價(jià) 表2中的Tmax經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，Cmax和AUC(0→24)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)和(1-2α)置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)。對(duì)酮咯酸氨丁三醇分散片和膠囊的Tmax采用非參數(shù)法進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，兩制劑Tmax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Cmax的90%置信區(qū)間為參比制劑的93.61%～103.13%，在70%～143%范圍內(nèi);受試制劑中酮咯酸氨丁三醇 AUC(0→24)的 90%置信區(qū)間為參比制劑的92.52% ～102.01%，在80% ～125%范圍內(nèi)，表明兩種制劑的Cmax、AUC(0→24)拒絕生物不等效假設(shè)，受試制劑與參比制劑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，受試制劑酮咯酸氨丁三醇分散片的相對(duì)于參比制劑酮咯酸氨丁三醇膠囊的生物利用度為97.86%±11.62%，兩種制劑的 Cmax、AUC(0→24)拒絕生物不等效假設(shè)，酮咯酸氨丁三醇分散片劑與膠囊劑具有生物等效性。

4 討論

有研究采用RP-HPLC法測(cè)定血漿中酮咯酸氨丁三醇濃度，優(yōu)化了血漿樣品處理方法，提高了方法靈敏度，減少了樣品內(nèi)源性干擾，方法重現(xiàn)性好，專一性強(qiáng)，可滿足酮咯酸氨丁三醇藥物動(dòng)力學(xué)及生物利用度研究要求［4-5］。酮咯酸氨丁三醇被人體吸收后，轉(zhuǎn)化為弱酸鹽酮咯酸，有較好的水溶性。如果采用直接沉淀蛋白進(jìn)樣測(cè)定，雖然方法簡便，但是血漿中的酮咯酸與雜質(zhì)無法有效分離，且在低濃度范圍監(jiān)測(cè)靈敏度達(dá)不到準(zhǔn)確定量要求。若直接采用有機(jī)溶劑也無法充分提取樣品中的酮咯酸鹽，可在樣品中加入0.6 mol/L硫酸溶液使其解離度降低，提高提取效率;最后精密加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液從正己烷中反萃出酮咯酸，不但去除樣品中脂溶性雜質(zhì)，還使酮咯酸的濃度進(jìn)行了富集，較直接沉淀法提高了檢測(cè)靈敏度。

流動(dòng)相選用磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH=2.5)-甲醇的原因是由于在該體系下，酮咯酸色譜峰峰形對(duì)稱性較甲醇-水體系更佳、理論塔板數(shù)更高。另外，磷酸二氫鉀可作為酮咯酸分子離解抑制劑，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，促使其在流動(dòng)相中以酮咯酸分子的形式存在，抑制離解，增強(qiáng)其在色譜柱上的保留，同時(shí)減少峰的拖尾，并顯著提高分離效果。

酮咯酸氨丁三醇分散片劑口服后較膠囊劑吸收更快，血藥濃度在約0.68 h即達(dá)峰濃度，而膠囊劑則要在0.8 h左右達(dá)峰，故分散片劑較膠囊劑鎮(zhèn)痛起效更快;考慮藥物制劑體外溶出的各種影響因素，說明體內(nèi)吸收差異主要是兩種劑型的生產(chǎn)工藝差異造成的。

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