徐 鯤，楊 敏，孫 靜，閆 榮，呂寶玉

(1.山東大學(xué)護(hù)理學(xué)院，山東濟(jì)南250012;2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東濟(jì)南250012;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，山東濟(jì)南250355;4.山東省腫瘤醫(yī)院，山東濟(jì)南250117)

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)聯(lián)合化療在臨床上已廣泛應(yīng)用?；熼_始越早，越有利于殺滅殘存的腫瘤細(xì)胞，防止擴(kuò)散。既往因擔(dān)心化療影響術(shù)后切口愈合，多在切口拆線后進(jìn)行化療，從而耽擱化療開始時(shí)間。因此，如何使用手術(shù)聯(lián)合化療而又不會對切口愈合造成太大的影響成為臨床上亟需解決的問題。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)是一種具有多項(xiàng)潛能的造血生長因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞趨向缺血組織，促進(jìn)血管新生和損傷血管的復(fù)內(nèi)皮化，而且對其他細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及皮膚黏膜細(xì)胞等具有刺激生長作用［1］。將該藥應(yīng)用于促進(jìn)手術(shù)聯(lián)合化療后的切口愈合，尚未見報(bào)道。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察其對切口愈合作用的影響及對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)的影響，為今后臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級新西蘭大白兔24只，雌雄各半，體質(zhì)量1.90～2.30 kg［山東省西嶺角種兔繁殖中心，許可證號:SCXK(魯)20090013］;欣粒生(北京四環(huán)生物制藥有限公司生產(chǎn)，批號:2010 0110)。

1.2 大白兔手術(shù)切口模型制備及給藥

用靜脈注射地西泮(0.7 mg/kg)，腹腔注射氯胺酮(40 mg/kg)聯(lián)合麻醉兔后，常規(guī)手術(shù)制作切口模型，取無菌刀切開腹部皮膚、筋膜層，暴露腹膜層后逐層縫合。

將兔隨機(jī)分為3組，每組8只?？瞻捉M(normal)8只，單純進(jìn)行手術(shù)，每天常規(guī)切口處換藥兩次;對照組(control)8只，手術(shù)前當(dāng)日給予表阿霉素靜脈輸注，每天常規(guī)切口處換藥兩次;治療組(treatment)8只，手術(shù)前當(dāng)日給予表阿霉素靜脈輸注，每日兩次切口換藥時(shí)涂抹重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。

1.3 觀察指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 切口感染:判定標(biāo)準(zhǔn)按照外科學(xué)分為:甲級愈合，乙級愈合和丙級愈合。感染率為(乙級愈合+丙級愈合)/(甲級愈合+乙級愈合+丙級愈合)×100%。

1.3.2 3組均于手術(shù)后第7天取切口部位組織:常規(guī)病理切片，HE染色。按照病理感染程度分級標(biāo)準(zhǔn)，無感染(0級):切片內(nèi)為肉芽組織;輕度感染(Ⅰ級):有少量中性白細(xì)胞彌散浸潤，感染壞死面積小于切片面積的10%;中度感染(Ⅱ級):有大量中性粒細(xì)胞浸潤，感染壞死面積大于10%，小于30%;重度感染(Ⅲ級):有大量中性粒細(xì)胞浸潤，感染壞死面積大于30%。

1.3.3 免疫組化法檢測VEGF:每張切片在200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察切口組織VEGF計(jì)數(shù)陽性表達(dá)率，無陽性細(xì)胞為(-)，陽性細(xì)胞比率＜25%為(+)，25% ～50%為(++)，50% ～75%為(+++)，＞75%為(++++)。

1.3.4 手術(shù)后第7天，耳源靜脈采血，使用酶聯(lián)免疫吸附法觀察腫瘤壞死因子α(α-tumor necrosis factor，TNF-α)水平。按照試劑盒說明進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對測量值進(jìn)行記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組切口愈合感染

各組手術(shù)后第1天均見切口處結(jié)痂。其后，空白組4例見創(chuàng)面少許滲出物并逐漸干燥，第8天A級愈合，4例局部滲液較多，輕微紅腫，換藥處理后第8天B級愈合，感染率50%;對照組5例局部滲液較多，紅腫，第8天B級愈合，3例分別于第4、5和5天出現(xiàn)切口化膿，經(jīng)局部引流，第10天C級愈合，感染率100%;治療組3例第8天A級愈合，5例見局部滲液增多，有紅腫，第8天B級愈合，感染率63%。空白組與治療組均低于對照組(P＜0.05)(表1)。

表1 3組手術(shù)切口愈合情況比較Table 1 Comparative wound healing of three groups after operation(n=8)

圖1 3組病理HE染色圖片F(xiàn)ig 1 Pathologic pictures in three groups by HE staining(×100)

第7天手術(shù)切口病理檢查(圖1)，空白組可見肉芽組織生長旺盛，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密，毛細(xì)血管增生明顯，少量中性粒細(xì)胞浸潤，局部感染壞死;對照組可見毛細(xì)血管內(nèi)皮不完整，局部組織結(jié)構(gòu)不清，可見大量中性粒細(xì)胞浸潤，片狀壞死組織較多;治療組見內(nèi)皮細(xì)胞核分裂象增多，毛細(xì)血管明顯增多，可見大量中性粒細(xì)胞浸潤，但壞死組織面積少。對照組明顯重于空白組和治療組(P＜0.05)(表2)。

2.2 各組免疫組化VEGF表達(dá)

病理免疫組化(圖2)，可見VEGF在表皮細(xì)胞、皮脂腺上皮細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞和部分血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒，為陽性表達(dá)。治療組陽性細(xì)胞百分比明顯高于空白組和對照組(P＜0.05)(表3)。

表2 3組病理感染程度檢查結(jié)果Table 2 Pathologic result on infection in three groups(n=8)

表3 3組VEGF免疫組化水平Table 3 Immunohistochemistry in three group of VEGF(n=8)

圖2 3組VEGF免疫組化Fig 2 Expression of VEGF in three groups by immunohistochemistry(HE×200)

2.3 各組TNF-α水平

TNF-α 水平(表4)，空白組17.73±7.21 ng/L、對照組9.79±4.31 ng/L、治療組11.69±4.45 ng/L，治療組雖高于對照組，但無顯著差異。

表4 3組外周靜脈血中TNF-α水平Table 4 TNF-α levels in peripheral vein serum of rabbit( ±s，ng/L，n=8)

表4 3組外周靜脈血中TNF-α水平Table 4 TNF-α levels in peripheral vein serum of rabbit( ±s，ng/L，n=8)

group TNF-α normal 17.73±7.21 control 9.79±4.31 treatment 11.69±4.45

3 討論

切口愈合過程主要分3個(gè)階段:炎性反應(yīng)階段、細(xì)胞增殖階段及結(jié)締組織形成階段和塑造階段。切口刺激的組織級聯(lián)反應(yīng)主要包括血管和組織細(xì)胞的炎性反應(yīng)、細(xì)胞的遷移、增殖和分化、血管和上皮形成、纖維增生和組織重建過程［2］。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性的有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性誘導(dǎo)因子。John Christoforidis等［3］使用抗VEGF的藥物進(jìn)行切口愈合的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用抗VEGF藥物后第7天切口部位新生血管明顯少于不使用藥物的對照組;有研究表明，敲除了白介素12/23的小鼠在傷口愈合時(shí)其VEGF表達(dá)明顯升高，從而能使愈合加快［4］。rhG-CSF是利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人粒細(xì)胞集落刺激因子，具有動(dòng)員血管內(nèi)皮祖細(xì)胞趨向缺血組織，促進(jìn)血管新生作用，而且對成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚黏膜細(xì)胞等具有刺激生長作用。本實(shí)驗(yàn)，通過局部外用rhG-CSF，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞核分裂象增多，增生旺盛，真皮層毛細(xì)血管明顯增多，大量中性粒細(xì)胞浸潤，支持rhG-CSF具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用和促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化降低局部感染程度作用。同時(shí)，用免疫組化方法測定兔手術(shù)切口處組織中的VEGF表達(dá)以明確rhG-CSF是否通過提高VEGF的水平，達(dá)到促進(jìn)切口愈合目的。結(jié)果表明，rhG-CSF局部外用，可以明顯增加切口部位組織的VEGF水平，從而促進(jìn)切口處血管的形成，促進(jìn)切口愈合，其具體作用的信號傳導(dǎo)通路需進(jìn)一步研究。

TNF-α是一種單核因子。目前研究表明，重組人腫瘤壞死因子α(recombinant human α-tumor necrosis factor，rh-TNF-α)的介入使傷口局部炎細(xì)胞浸潤明顯，提高了早期炎性反應(yīng)的水平，同時(shí)使抗感染能力提高，并且有助于一些細(xì)胞因子如表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板源生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)等及其他炎性介質(zhì)的分泌表達(dá)，產(chǎn)生促進(jìn)傷口愈合作用［5］。本研究結(jié)果表明，rhG-CSF對手術(shù)合并化療的大白兔無提高外周血TNF-α水平的作用，考慮原因可能與化療后的骨髓抑制使單核細(xì)胞減少，從而分泌的TNF-α減少有關(guān)，這也是化療藥物抑制切口愈合的可能機(jī)制之一。

綜上所述，在手術(shù)加化療的同時(shí)使用rhG-CSF局部外用，對家兔具有促進(jìn)手術(shù)切口愈合作用，值得今后在臨床上進(jìn)一步研究。

［1］Sari A，Gurbuz O，Yilmaz N，et al.Granulocyte-colony stimulating factor improves the survival of ischaemic skin flaps by the induction of angiogenesis［J］.J Plast Reconstr Aesthet Surg，2009，62:1035-1041.

［2］Garlet GP，Horwat R，Ray HL Jr，et al.Expression analysis of wound healing genes in human periapical granulomas of progressive and stable nature［J］.J Endod，2012，38:185-190.

［3］ John Christoforidis，Robert Ricketts，Cedric Pratt，et al.The effect of intravitreal anti-VEGF agents on peripheral wound healing in a rabbit model［J］.Clin Ophthalmology，2012，6:61-69.

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［5］吳洋，周樹夏，李秀娟，等.外源性rh-TNF-α局部介入對創(chuàng)傷愈合的影響［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22:1120-1122.